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抗体靶向的长循环阳离子脂质体介导DNA和siRNA转染的制剂学研究

作　者: 张扬
导　师: 陈建明
学　校: 第二军医大学
专　业: 药剂学
关键词: 阳离子脂质体抗体靶向长循环转染效率脱氧核糖核酸小干扰RNA
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近年来,我国女性乳腺癌的发病率迅速上升。乳腺癌已经是危害我国妇女健康的主要恶性肿瘤之一。目前,乳腺癌的常用治疗手段主要是手术治疗、放射治疗和化疗。这些手段虽然可使患者获得较高的生存率甚至治愈,但术后复发及远处转移的问题仍然是困扰学者们的一大难题。随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展和人类对乳腺癌发病机制认识的不断深入,基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分,在乳腺癌治疗中显示出良好的应用价值,并且取得了一定的效果,日渐成为一项有前景的治疗选择。目前基因治疗的研究和临床应用中常用的载体分为病毒载体和非病毒载体,各个载体均有各自的优缺点,病毒载体主要的潜在缺点包括:①致病可能性;②免疫原性;③大规模生产的困难性。而非病毒导入系统正受到更多的关注,它的主要的优点包括安全,容易大规模生产等,主要缺点是不能获得较高水平的基因导入和表达[1-3]。阳离子脂质体(Cationic liposomes, CL)是目前用于基因治疗的研究最广泛的非病毒类载体之一,具有毒性低、转移的核苷酸大小范围广(从寡核苷酸到人工染色体均可)、制备方法较简单等优点。但是该载体仍存在转染效率较低、靶向性差等问题。设计合理的CL微粒给药体系,以提高目的基因的高效靶向表达是当前药剂学研究的热点之一[3-4]。在乳腺癌患者中,约有25-30%乳腺癌病人的癌组织表达HER2,而且这些HER2阳性的病例往往发展快,对多种化疗和内分泌治疗不敏感,预后较差,容易转移复发。HER2是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体。目前抗HER2治疗的途径主要有以下几类:①抗HER2单克隆抗体,通过封闭乳腺癌细胞表面HER2受体,阻断其与各种生长因子的结合,从而抑制受体激活;②酪氨酸激酶抑制剂;③反义基因技术。但由于抗HER2单克隆抗体本身限制及酪氨酸激酶抑制剂副作用较严重,而反义基因方法抑制基因表达的效果又较弱,故他们都不能达到满意的临床效果。因此,开发一种更加有效、安全的抗HER2药物成为研究的热点。本研究制备的制剂,以靶向乳腺癌细胞株HER2抗原的人源化单克隆抗体Fab’片段作为载质粒DNA或小干扰RNA的PEG化的免疫脂质体的靶向配体,这样可以特异性的将质粒DNA或小干扰RNA运载到体内HER2高表达的乳腺癌组织。本研究同时进行了靶向性的免疫长循环阳离子脂质体介导siRNA转染的制剂学研究及体外细胞学研究(Long-circulating Cationic Immunoliposomes,CIL)及非靶向性的长循环阳离子脂质体(Long-circulating Cationic liposomes,LCL)介导DNA和siRNA转染的制剂学研究及体外细胞学研究。对于非靶向的阳离子脂质体(含PEG和不含PEG),粒径分析结果为:在未复合物核酸之前,阳离子脂质体的粒径为150 nm左右。一旦复合核酸,脂质体/核酸复合物的粒径呈有规律的变化。随着DC-chol/核酸比例的升高,脂质体/核酸粒径呈先升高后降低的趋势。脂质体/DNA的峰值出现在DC-chol/DNA = 2,而脂质体/siRNA的峰值出现在DC-chol/DNA = 3或5。非靶向阳离子脂质体的zeta电位一般来讲均为正值,随着DC-chol/DNA或siRNA比值越来越高,脂质体的zeta电位越来越大,然而超过一定数值时,zeta电位出现平台期。凝胶阻滞实验结果:当DC-chol/DNA = 2,凝胶恰好将DNA阻滞住;而siRNA的包封率曲线结果:当DC-chol/siRNA = 3或5时,绝大部分的脂质体的siRNA包封率接近100%。PEG对非靶向阳离子脂质体的DNA结合能力影响轻微。然而,PEG化能大大减弱非靶向阳离子脂质体对siRNA的结合能力,甚至在DC-chol/siRNA > 15时,脂质体均不能将siRNA完全阻滞住。阳离子脂质体的核酸稳定性分析是通过DNA的DNaseI酶切实验和siRNA的血清稳定性实验来验证的。结果表明非靶向阳离子脂质体能显著增加核酸的稳定性。非靶向阳离子脂质体的转染实验以DC-chol和DOPE的比例,DC-chol和核酸的质量比、PEG(聚乙二醇)修饰的程度以及有无血清全面评估了影响阳离子脂质体转染的因素,得到了最适合进行基因转染的DOPE/DC-chol脂质体。于质粒DNA来说,最优的DC-chol/DOPE比例为1/2,而对于siRNA来说,最优的DC-chol/DOPE比例为1。PEG对本研究中的阳离子脂质体影响巨大,随着PEG含量的增加,转染效率呈现明显的下降趋势。血清对非靶向阳离子脂质体的DNA转染效率影响不大。有血清转染和无血清转染没有明显的转染效率差异;血清对DC-chol/DOPE脂质体的siRNA转染效率影响较大。对于不同配比的DC-chol/DOPE脂质体来说,无血清转染效率要高于有血清转染效率。对于靶向HER2的免疫阳离子脂质体(Liposomes conjugated with Anti-HER2 Fab’,HER2-Flip),本研究将Anti-HER2 Fab’作为靶向性抗体片段连接于含4%PEG的阳离子脂质体的表面——抗体靶向的方式,并通过体外实验证实,HER2-Flip能特异性靶向高表达HER2的SK-BR3乳腺癌细胞株并被内吞,而且Real-time PCR实验证实了其能特异性沉默VEGF基因的表达。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
缩略词表  12-13
前言  13-15
第一章免疫长循环阳离子脂质体的制剂学研究  15-30
  一、仪器与材料  15-16
    （一）主要仪器设备  15
    （二）主要材料  15-16
  二、方法与结果  16-28
    （一）免疫长循环阳离子脂质体的制备  16-24
    （二）免疫长循环阳离子脂质体体外相关性质考察  24-28
  三、讨论  28
  四、小结  28-30
第二章长循环阳离子脂质体/DNA 复合物的制剂学研究及体外研究  30-52
  一、仪器与材料  30-32
    （一）主要仪器设备  30-31
    （二）主要材料  31-32
  二、方法与结果  32-49
    （一）阳离子脂质体/DNA 复合物的粒径测定  32
    （二）长循环阳离子脂质体/DNA 复合物的粒径测定  32-33
    （三）阳离子脂质体/DNA 复合物的zeta 电位测定  33
    （四）长循环阳离子脂质体/DNA 复合物的zeta 电位测定  33-35
    （五）阳离子脂质体/DNA 复合物的凝胶阻滞实验  35-36
    （六）长循环阳离子脂质体/DNA 复合物的凝胶阻滞实验  36-37
    （七） DNaseI 酶切实验  37-41
    （八）转染实验  41-46
    （九）细胞毒性实验  46-49
  三、讨论  49-50
    （一）阳离子脂质体/DNA 复合物的纳米表征分析  49
    （二）阳离子脂质体的DNA 包裹能力分析  49
    （三）阳离子脂质体/DNA 复合物的稳定性分析  49-50
    （四）阳离子脂质体/DNA 复合物的转染效率分析  50
  四、小结  50-52
第三章长循环阳离子脂质体/siRNA 复合物的制剂学研究及体外研究  52-77
  一、仪器与材料  52-54
    （一）主要仪器设备  52
    （二）主要材料  52-54
  二、方法与结果  54-74
    （一）阳离子脂质体/siRNA 复合物的粒径测定  54
    （二）长循环阳离子脂质体/siRNA 复合物的粒径测定  54-55
    （三）阳离子脂质体/siRNA 复合物的zeta 电位测定  55
    （四）长循环阳离子脂质体/siRNA 复合物的zeta 电位测定  55-56
    （五）阳离子脂质体/siRNA 复合物的凝胶阻滞实验  56-58
    （六）长循环阳离子脂质体/siRNA 复合物的凝胶阻滞实验  58-59
    （七）超滤离心法测定siRNA 的包封率[38-39]  59-61
    （八） siRNA 血清稳定性实验  61-62
    （九）转染实验  62-67
    （十）细胞毒性实验  67-70
    （十一）基因沉默效率实验  70-74
  三、讨论  74-75
    （一）阳离子脂质体/siRNA 复合物的纳米表征分析  74
    （二）阳离子脂质体的siRNA 包裹能力分析  74-75
    （三）阳离子脂质体/siRNA 复合物的稳定性分析  75
    （四）阳离子脂质体/siRNA 复合物的转染效率分析  75
  四、小结  75-77
第四章免疫长循环阳离子脂质体/siRNA 复合物体外研究  77-91
  一、仪器与材料  77-80
    （一）主要仪器设备  77-78
    （二）主要材料  78-80
  二、方法  80-83
    （一）靶向HER2 的免疫阳离子脂质体（HER2-Flip）的制备  80
    （二） HER2-Flip 和游离Anti-HER2 Fab’的分离  80
    （三） HER2-Flip 的体外靶向性  80-81
    （四） HER2-Flip-siRNA 的直接结合曲线  81
    （五）流式观察HER2-Flip-siRNA 对HER2 表达水平不同的乳腺癌细胞株的结合  81-82
    （六）共聚焦观察HER2-Flip-siRNA 在HER2 高表达的乳腺癌细胞株中结合和内吞  82
    （七） HER2-Flip-siRNA 的基因沉默效率  82-83
  三、结果和讨论  83-90
    （一）靶向HER2 的免疫阳离子脂质体（HER2-Flip）的制备  83
    （二） HER2-Flip 和游离Anti-HER2 Fab’的分离  83
    （三） HER2-Flip 的体外靶向性  83-85
    （四） HER2-Flip-siRNA 的直接结合荧光强度曲线  85-86
    （五）流式观察HER2-Flip-siRNA 对HER2 表达水平不同的乳腺癌细胞株的结合  86-87
    （六）共聚焦观察HER2-Flip-siRNA 的结合和内吞  87-88
    （七） HER2-Flip-siRNA 的基因沉默效率  88-90
  四、小结  90-91
全文总结  91-94
参考文献  94-99
综述转运siRNA 的抗肿瘤靶向阳离子脂质体的研究进展  99-108
在读期间发表论文和申请专利情况  108-109
致谢  109

抗体靶向的长循环阳离子脂质体介导DNA和siRNA转染的制剂学研究

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