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X-连锁肾上腺—脑白质营养不良患者ALD基因突变分析及ALDP突变体的原核表达

作　者: 谢海花
导　师: 兰风华
学　校: 福建医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肾上腺脑白质营养不良 ALDP 基因克隆分子诊断产前诊断
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

X-连锁肾上腺-脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD)是最常见的过氧化物酶体病,主要侵犯肾上腺和脑白质等器官。X-ALD是由ABCD1基因突变所致,该疾病基因定位于染色体Xq28,其成熟mRNA长约3.7kb,编码一个含745个氨基酸残基的蛋白质,称为ALDP,又称为ABCD1蛋白。X-ALD的发病机制是由于体内的极长链饱和脂肪酸(saturated very long chain fatty acid,VLCFA)不能进入过氧化物酶体进行β-氧化,从而过度蓄积,导致脑白质脱髓鞘改变及肾上腺皮质功能减退。患者一旦发病,往往产生不可逆的神经系统症状。应用分子诊断方法,对X-ALD患者及其家系成员的ABCD1基因进行分析,确定患者的ABCD1基因突变位点和类型以及家系其他成员的基因型,不仅可为X-ALD患者提供明确的诊断,而且可为遗传咨询、产前诊断提供依据。本研究分别从总RNA和基因组DNA两条途径对5个X-ALD家系进行分子诊断。以mRNA为模板,采用长链RT-PCR技术,分4个片段扩增ABCD1编码序列并对其PCR产物进行直接测序,同时通过PCR产物直接测序、DHPLC和限制性内切酶分析患者及其家系成员相应的基因组DNA片段,进一步确证所发现的基因突变,同时对所发现的ABCD1基因一个新的突变及对其ALDP结构的影响进行生物信息学分析。结果显示:5个X-ALD家系患者的ABCD1基因上均存在突变,其中患者1的ABCD1基因第512位密码子发生了GGC→AGC突变,使原来编码的甘氨酸被丝氨酸取代(G512S);患者2的ABCD1基因第471位密码子发生了移码突变,使原来编码的氨基酸序列发生改变(fs Glu471);患者3的ABCD1基因发生了多重突变在第217位密码子发生了AAG→GAG突变,使原来编码的赖氨酸被谷氨酸取代(K217E)。同一等位基因还在第489位密码子发生了GTG→GTA同义突变,氨基酸种类没发生改变(V489V);患者4的ABCD1基因第283位密码子发生了CAC→CGC突变,使原来编码的组氨酸被精氨酸取代(H283R);患者5的ABCD1基因第283位密码子发生了CAC→GAC突变,使原来编码的组氨酸被天冬氨酸取代(H283D)。经查阅国内外文献及www.X-ald.nl数据库,H283R突变尚未见报道,突变所改变的氨基酸残基在进化上高度保守。p.H283R发生在ALD蛋白的ABC转运体跨膜蛋白结构域,能引起该分子跨膜区整体结构的改变。患者1的p.G512S突变未见于其亲代,为新生突变(de novo mutation);在家系2中,患者表哥的ABCD1基因也存在同样的突变位点,但尚未出现临床症状,为症状前诊断;患者3的基因突变属于多重突变:p.[K217E+V489V];在家系4中,有3名杂合子女性X-ALD患者,为国内首次报道。在证实先证者的ABCD1基因突变后,本研究对3个X-ALD高风险胎儿进行产前分子诊断。在妇产科医师的配合下,抽取羊水,提取羊水细胞基因组DNA,采用亲子鉴定试验评估母体基因组DNA污染,用PCR-RFLP和DNA测序对胎儿羊水基因组DNA的ABCD1基因进行分析。结果显示:在家系1中,用MaeI切割407bp的PCR产物,胎儿1与其母亲酶切模式一致,PCR产物测序发现胎儿1的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(Q177X);在家系2中,PCR产物测序未发现胎儿2的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(fs Glu471突变);在家系3中,PCR产物测序发现胎儿3的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(K217E+V489V)。亲子鉴定试验还显示,胎儿1、2为女性,胎儿3为男性,由此推断胎儿1为X-ALD携带者,胎儿2为正常纯合子,胎儿3为X-ALD半合子。本研究还利用分子克隆技术,将该基因的全长序列、TMD编码序列和NBD编码序列分别插入GST融合表达载体(pGEX-4T-2),构建了三个原核重组表达载体。用定点突变试剂盒对构建好的原核重组表达载体进行三个位点(P508L、G512S、R617C)的诱导突变,制备突变体的原核重组表达载体,并在E.coli BL21中表达。经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹证实为ALD蛋白ATP结合区(NBD)的融合蛋白,采用GST融合蛋白纯化试剂盒对野生型和三个突变型的NBD-GST融合蛋白进行纯化。3个ALDP突变体的原核表达,为将来研究X-ALD的分子发病机理以及突变对ALDP结构和功能的影响奠定了基础。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
研究内容  14-74
  第一部分 5 个X-肾上腺-脑白质营养不良家系的基因突变分析  14-39
    材料和方法  15-25
    结果  25-36
    讨论  36-39
  第二部分 3 个X-肾上腺-脑白质营养不良高风险胎儿的产前分子诊断  39-53
    材料和方法  40-45
    结果  45-51
    讨论  51-53
  第三部分 X-连锁肾上腺-脑白质营养不良蛋白的原核表达和定点突变研究  53-74
    材料和方法  54-62
    结果  62-71
    讨论  71-74
小结  74-75
参考文献  75-80
综述  80-90
致谢  90-91
在读期间发表(投稿)的论文目录  91

X-连锁肾上腺—脑白质营养不良患者ALD基因突变分析及ALDP突变体的原核表达

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