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成年皮肤成纤维细胞克隆绵羊的生产

作　者: 王申元
导　师: 刘俊平；周欢敏
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 核移植 胚胎移植 克隆绵羊 孤雌激活
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本实验通过不同激活方法对绵羊体外成熟卵母细胞孤雌激活胚胎早期发育效果进行了比较分析,为绵羊体细胞核移植后重构胚的激活奠定了一定的基础;比较了不同融合电压对重构胚发育的影响;比较了不同胚龄重构胚的胚胎移植对产羔率的影响。在37℃、5%CO2、饱和湿度下,采用10%FBS的DMEM/F12培养液和组织块直接培养法培养绵羊皮肤成纤维细胞,有效的建立了绵羊皮肤成纤维细胞系。通过生长曲线测定和染色体计数可确定分离培养的绵羊皮肤成纤维细胞基本符合体外培养细胞生长特性。电激活和化学激活方法都可有效激活绵羊卵母细胞,但离子霉素联合6-DMAP激活绵羊卵母细胞的卵裂率和桑椹\囊胚率为78.90%和41.95%,优于7%乙醇联合6-DMAP的卵裂率75.47%和桑椹\囊胚率37.11%;显著高于电激活的卵裂率57.68%和桑椹\囊胚率18.31%。对处于不同胚龄的克隆胚采用手术法进行胚胎移植,融合胚、2-16cell胚、桑囊胚的妊娠率分别为14.4%、0、3.4%。以融合胚妊娠率最高,差异显著。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
1 引言  9-20
  1.1 核移植概念  9-10
  1.2 核移植发展历程  10-13
    1.2.1 核移植历史回顾  10-11
    1.2.2 核移植研究现状  11
    1.2.3 核移植应用前景  11-13
  1.3 核移植机理的研究  13-14
    1.3.1 成熟促进因子（MPF）在重编程中所起的作用  13
    1.3.2 DNA 甲基化  13
    1.3.3 核质相互作用  13-14
  1.4 核移植的技术程序  14-19
    1.4.1 受体细胞的准备  14-16
    1.4.2 供体细胞的准备  16
    1.4.3 重构胚的构建  16-17
    1.4.4 重构胚激活  17-19
    1.4.5 重构胚的培养  19
  1.5 体细胞核移植存在的问题  19-20
2 实验研究  20-37
  2.1 绵羊皮肤成纤维细胞的分离和培养  21-23
    2.1.1 绵羊皮肤的采集  21-22
    2.1.2 原代培养  22
    2.1.3 皮肤成纤维细胞与上皮样细胞的纯化  22
    2.1.4 绵羊成纤维细胞的冷冻保存及解冻  22
    2.1.5 绵羊皮肤成纤维细胞生长曲线  22-23
    2.1.6 绵羊成纤维细胞染色体的制备  23
  2.2 绵羊卵母细胞的采集  23-24
    2.2.1 卵巢卵母细胞的采集  23
    2.2.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养  23
    2.2.3 成熟卵的检查  23-24
  2.3 卵母细胞的孤雌激活及发育培养  24
    2.3.1 电激活  24
    2.3.2 化学激活  24
  2.4 绵羊克隆的程序  24-26
    2.4.1 核供体的准备  24-25
    2.4.2 核移植  25
    2.4.3 融合  25
    2.4.4 重构胚的激活及体外培养  25
    2.4.5 受体羊的准备  25-26
    2.4.7 克隆绵羊围产期的维护  26
    2.4.8 克隆绵羊的鉴定  26
  2.5 结果  26-32
    2.5.1 绵羊皮肤成纤维细胞原代和传代培养  26-27
    2.5.2 绵羊皮肤成纤维细胞的生长曲线  27
    2.5.3 绵羊皮肤成纤维细胞染色体数目  27
    2.5.4 不同激活电压对绵羊卵母细胞孤雌激活的结果  27-28
    2.5.5 不同激活方法处理绵羊卵母细胞的孤雌激活结果  28-29
    2.5.6 不同融合电压对核移植效率的影响  29
    2.5.7 不同胚龄重构胚的胚胎移植结果  29-30
    2.5.8 克隆羊的鉴定结果  30-32
  2.6 讨论  32-36
    2.6.1 绵羊皮肤成纤维细胞的培养  32-33
    2.6.2 卵母细胞的孤雌激活  33
    2.6.3 供体细胞的处理方式对重构胚的影响  33-34
    2.6.4 不同融合参数对重构胚的影响  34-35
    2.6.5 不同胚龄重构胚胚胎移植对妊娠的影响  35
    2.6.6 克隆动物对其成活率的影响  35-36
  2.7 结论  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-44
附图  44-47
作者简介  47

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 细胞工程
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