学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2的构建及其在CHO细胞中的表达

作　者: 陈欣欣
导　师: 张彦；何永蜀；杨芳；李文辉
学　校: 昆明医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: CLEC-2 CHO细胞 基因克隆 真核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 143次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


人CLEC-2是一种C型凝集素样受体,它能通过结合到蛇毒蛋白rhodocytin上,引发一系列的信号传导,从而介导血小板的激活和聚集,CLEC-2是蛇毒蛋白rhodocytin的血小板表面受体。同是它也是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的共同受体。所以研究CLEC-2,可以指导设计抗血小板激活和聚集的药物,为心血管血栓性疾病的治疗,甚至为研究HIV的传播提供基础。目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2并检测其在真核细胞CHO内的表达水平。方法:1.真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2的构建:根据GenBank收录的CLEC-2的基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物,并在每条引物5’端加上限制性酶切位点。用RNA提取试剂盒从人血小板中提取总RNA。用RT-PCR方法,扩增目的基因CLEC-2片段。然后用胶回收试剂盒纯化PCR产物。再用T4 DNA连接酶连接经HindⅢ和EcoRⅠ酶切的CLEC-2 PCR产物和用相同酶切过的pcDNA3.1(+)载体,构建pcDNA3.1(+)-CLEC2真核表达质粒,氨苄青霉素筛选阳性克隆,再经菌落PCR、酶切和测序进行鉴定。2.重组质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2转染CHO细胞:应用脂质体转染技术,将重组质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2转染CHO细胞,48小时后用G418筛选30天,获得稳定表达的CHO细胞,用Western blot方法从蛋白质水平检测CLEC-2基因的表达。结果:1.通过RT-PCR扩增获得CLEC-2目的基因片段。2.成功构建pcDNA3.1(+)-CLEC2真核表达质粒,经PCR和HindⅢ、EcoRⅠ酶切鉴定证实其目的片段大小与预期的一致;经测序证实其基序列与GenBank公布的一致。3.建立稳定表达CLEC-2的CHO细胞株,用Western blot在蛋白质水平检测CLEC-2基因的表达。结论:1.成功构建pcDNA3.1(+)-CLEC2真核表达载体。2.获得能稳定表达CLEC-2的CHO细胞株。3.为下一步纯化CLEC-2蛋白和探讨其活性提供了实验基础。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
缩略词  10-12
引言  12-14
技术路线  14-15
第一部分 CLEC-2目的片段的获得  15-21
  一、实验材料  15
  二、主要仪器  15
  三、主要试剂  15
  四、主要溶液的配制  15-16
  五、实验方法及步骤  16-21
    1.人血小板总RNA的提取  16-17
    2.RT-PCR  17-21
第二部分 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2的构建和鉴定  21-29
  一、主要试剂  21
  二、主要仪器  21
  三、主要溶液的配制  21-22
  四、实验方法及步骤  22-29
    1.双酶切纯化的CLEC-2 PCR产物  22-23
    2.双酶切pcDNA3.1(+)  23
    3.pcDNA3.1(+)-CLEC2重组DNA分子的构建  23-29
第三部分 pcDNA 3.1(+)-CLEC2重组体的表达  29-33
  一、细胞株  29
  二、主要仪器  29
  三、主要试剂  29
  四、主要溶液的配制  29-30
  五、实验方法及步骤  30-33
    1.CHO细胞的复苏与培养  31
    2.重组体转染CHO细胞  31-32
    3.G418筛选稳定株  32-33
第四部份 Western blot检测目的基因的表达  33-38
  一、主要仪器  33
  二、主要试剂  33
  三、主要溶液的配制  33-35
  四、实验方法及步骤  35-38
    1.细胞裂解  36
    2.Western blot蛋白样品的处理  36
    3.Western blot具体步骤  36-38
结果  38-49
  一、RT-PCR扩增目的基因  38
  二、pcDNA3.1(+)-CLEC2重组体菌落PCR鉴定  38-39
  三、pcDNA3.1(+)-CLEC2重组体的双酶切定  39-40
  四、pcDNA3.1(+)-CLEC2重组体的测序及序列比对结果  40-46
  五、重组质粒纯度及浓度测定结果  46-47
  六、CHO细胞的转染与筛选  47
  七、LEC-2目的蛋白在CHO细胞中的表达  47-49
讨论  49-56
  一、关于表达载体的构建  49-51
  二、真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2的转染和表达  51-55
  三、展望  55-56
结论  56-57
参考文献  57-59
附录  59-61
文献综述  61-68
在校期间论文发表情况  68-69
致谢  69

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
  3. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  4. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  5. 硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究,S511
  6. 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及猪α干扰素的真核表达,S858.28
  7. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  8. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  9. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  10. 产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能分析,TQ925
  11. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  12. 荧光假单胞菌7-14生物膜突变株的筛选及tatC基因的克隆与功能初析,S432.4
  13. 新疆小麦1Dx5基因的分离克隆及表达载体构建,S512.1
  14. 短柄草磷转运蛋白基因的克隆与功能分析,S543.9
  15. 多个猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体的分子生物学特征,S828
  16. 陆地棉Aux/IAA家族九个基因的克隆和表达分析,S562
  17. 萝卜耐热性鉴定与热激蛋白基因克隆,S631.1
  18. 外来入侵植物紫茎泽兰冷驯化相关基因ICE1的克隆,S451
  19. 菊花花色嵌合体生物学特性及形成机理的研究,S682.11
  20. 萝卜霜霉病抗性鉴定与相关基因克隆,S631.1
  21. 基于Fosmid文库和PCR筛选技术的蜘蛛包卵丝蛋白基因克隆及分析,Q78

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com