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杨树CCR基因RNAi表达载体的构建及其转化研究

作　者: 蔡诚
导　师: 项艳
学　校: 安徽农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 杨树 RNAi CCR 农杆菌介导遗传转化木质素
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物,林木中木质素占木材干重的15%～36%,木质素生物合成及调节在植物生长和发育中发挥重要作用,另一方面,木质素是制浆造纸业的不利因素,脱除纤维素中的木质素,需要消耗大量能源和使用有毒化学物质,提高了造纸成本并污染环境。近十几年来,随着人们对木质素生物合成研究的深入,木质素生物合成途径许多酶的编码基因被不断分离克隆出来,调控木质素生物合成途径中重要酶基因的表达,通过抑制酶的活性,从而阻断木质素生物合成途径,降低木质素的合成量或单体组成,已经在烟草和杨树等植株上取得了成功。因此,利用生物技术手段降低木质素含量或改变其组成,提高杨树的制浆性能,创造出符合造纸原料要求的林木品种,对于降低制浆造纸的经济成本和保护环境等都具有重要意义。CCR是木质素生物合成途径的关键酶之一,在木质素生物合成途径中处于终端位置。RNAi(RNA interference)是一种重要的基因沉默方式,在植物基因功能和遗传改良研究中广泛应用。为优化和建立杨树遗传转化体系,探讨RNAi技术在杨树木质素改良中的应用效果,建立杨树RNAi的分子育种新方法,本文以南林95叶片为外植体,对农杆菌介导的遗传转化体系进行较系统地研究,构建了肉桂酰辅酶A还原酶基因CCR干涉表达载体pBI121+2F,开展了农杆菌介导的杨树遗传转化,并对转化植株进行了筛选、PCR检测和木质素含量检测,获得了如下主要结果:1、采用改良的CTAB法提取南林95的基因组DNA,利用PCR技术克隆得到CCR基因的第4个外显子部分序列,并将其正向和反向克隆到pUCCRNAi载体上,通过酶切、纯化、连接、转化等一系列基因工程操作方法构建了含CaMV35S组成型启动子和卡那霉素筛选基因的RNAi表达载体pBI121+2F,并将其成功的导入农杆菌LBA4404中。2、以南林95为试材,对其叶片再生体系进行了优化,建立了高效的叶盘法农杆菌遗传转化体系,并获得了经抗Kan筛选的RNAi片段的转基因植株。(1)以MS为基本培养基附加不同浓度的6-BA和NAA,优化了南林95的组织培养扩繁体系,外植体培养基(MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8 g/L)诱导芽增殖,生根培养基为[1/2MS+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖15 g/L+琼脂8 g/L]。(2)用导入pBI121质粒的农杆菌液转化南林95叶片,通过正交试验设计,建立了最佳遗传转化体系,即外植体预培养7 d,在含AS 200μmol/L的菌液浓度为0.6的农杆菌液中侵染20 min,共培养3 d,其中适宜的Kan分化筛选浓度为50 mg/L,生根筛选浓度为30 mg/L。(3)利用筛选出来的最佳遗传转化体系转化目的片段,获得了具有RNAi片段的转基因植株。3、对获得的转基因植株进行PCR检测,获得了RNAi片段的转基因植株。对培养3个月的转基因植株进行Klason木质素分析,与对照植株相比,木质素含量降低20%～30%,且转基因植株的形态和生长发育未见异常。结果表明,利用RNAi技术抑制CCR基因表达,能有效降低植株的木质素含量。综上所述,通过构建CCR基因RNAi表达载体,建立杨树优良无性系叶片遗传转化体系,培育出速生、优质的杨树新品种,为进一步深入了解木质素生物合成提供了研究材料,也为其他树种的木质素基因工程改良奠定理论基础。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-10
1 文献综述  10-21
  1.1 木质素生物合成途径  10-13
    1.1.1 苯丙烷类代谢途径  11-13
    1.1.2 木质素特异合成途径  13
  1.2 木质素基因工程研究进展  13-17
    1.2.1 木质素总量合成的生物调控  14-15
    1.2.2 木质素单体特异合成相关酶的调控  15-17
  1.3 RNAi机制和原理  17-18
  1.4 杨树遗传转化技术  18-21
    1.4.1 农杆菌介导法  19-20
    1.4.2 外源DNA直接导入法  20-21
2 引言  21-23
  2.1 本课题的研究意义  21
  2.2 本研究的内容、目标  21-22
    2.2.1 研究内容  21-22
    2.2.2 研究目标  22
  2.3 本研究采用的技术路线  22-23
3 材料和方法  23-35
  3.1 实验材料  23-24
    3.1.1 植物材料  23
    3.1.2 菌株和质粒  23-24
    3.1.3 目的基因片段CCR  24
    3.1.4 CCR基因PCR反应的引物  24
    3.1.5 转化植株PCR检测的引物  24
  3.2 主要仪器设备和试剂  24-26
    3.2.1 主要仪器设备  24-25
    3.2.2 主要试剂  25
    3.2.3 有关试剂和培养基的配制  25-26
  3.3 试验方法  26-35
    3.3.1 杨树叶片的组织培养  26
    3.3.2 目的基因片段的确定  26-28
    3.3.3 RNAi+2F载体的构建  28-31
    3.3.4 pBI121+2F干涉表达载体的构建  31
    3.3.5 pBI121+2F干涉表达载体转化农杆菌  31-32
    3.3.6 卡那霉素抗性筛选  32
    3.3.7 杨树最佳遗传转化体系的建立  32-34
    3.3.8 目的基因转化南林95  34
    3.3.9 转化植株的PCR检测  34
    3.3.10 转化植株木质素含量的检测  34-35
4 结果与分析  35-44
  4.1 目的基因片段的获得  35
    4.1.1 杨树基因组提取  35
    4.1.2 目的干涉片段的扩增  35
  4.2 载体构建验证  35-37
    4.2.1 RNAi载体的构建  35-36
    4.2.2 克隆干涉片段2F的序列分析  36
    4.2.3 pBI121+2F表达载体构建验证  36-37
  4.3 干涉载体直接导入农杆菌的验证  37-38
    4.3.1 酶切验证  37
    4.3.2 PCR验证  37-38
  4.4 卡那霉素筛选浓度的确定  38-39
    4.4.1 南林95叶片分化的卡那霉素敏感性试验  38
    4.4.2 南林95生根的卡那霉素敏感性试验  38-39
  4.5 遗传转化体系正交试验设计分析  39-42
    4.5.1 正交试验结果的直观分析  39
    4.5.2 因素内各水平对遗传转化的影响  39-42
  4.6 目的基因的转化  42
  4.7 抗性植株PCR检测  42
  4.8 转基因株木质素含量测定  42-44
5 结论  44-45
6 讨论  45-47
  6.1 pBI121+2F表达载体的构建  45
  6.2 Kan筛选临界浓度的确定  45-46
  6.3 杨树最佳遗传转化体系的建立  46-47
参考文献  47-58
附录  58-63
致谢  63-64
作者简介  64
成果清单  64

杨树CCR基因RNAi表达载体的构建及其转化研究

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