学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

STIM1在缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用的初步研究

作　者: 后显华
导　师: 高钰琪
学　校: 第三军医大学
专　业: 病理生理学
关键词: 基质交感分子1 RNA干扰 肺动脉平滑肌细胞 缺氧 细胞增殖 钙库操控性钙通道 活化T细胞核因子
分类号: R541.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 47次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


我国是世界上高原面积最大、海拔最高、高原居住人口最多的国家。高原心脏病是我国高原地区的多发性常见疾病,对高原人群健康具有很大危害。目前研究认为缺氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension, HPH）是高原心脏病和慢性肺源性心脏病等疾病发生的中心环节,阐明其发生机制是防治这些疾病的关键所在。HPH的主要病理变化特征是缺氧性肺血管收缩（hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV）和肺血管结构重塑（hypoxic pulmonary vessel remodeling,HPVR）。既往研究认为缺氧可抑制肺阻力血管平滑肌细胞（pulmonary smooth muscle cells,PASMCs）电压依赖性钾离子通道（voltage-gated potassium channel, Kv ） ,导致胞膜去极化,从而激活电压依赖性钙通道（voltage-dependent calcium channel, VDCC）,胞外钙离子内流增加,引起缺氧性肺血管收缩反应和血管重构。但近来的研究表明,钙库操纵性钙通道（store-operated calcium channel, SOC）在缺氧肺动脉血管重构过程中的作用同样不可小视。一方面, HPH大鼠PASMCs胞膜上SOC介导钙内流（store-operated calcium entry, SOCE）显著增加,另一方面,去除慢性缺氧小鼠PASMCs细胞外钙离子,平滑肌细胞增殖将停止,提示持续的细胞外钙的内流是细胞增殖所必需的,并且这种钙浓度的维持不被电压依赖性钙通道阻断剂硝苯地平（nifedipine）所阻断,但可被SOC的阻断剂Ni2+和SKF-96365所抑制,提示SOC是缺氧引起PASMCs细胞外钙内流的重要途径。SOC是一种新发现的存在于细胞膜表面的钙通道,该通道的开放和关闭不受细胞膜电位调控而是受钙库内的钙离子含量调控。在平滑肌细胞中SOC和细胞收缩、基因表达、细胞生长与增殖关系密切。关于SOC的激活机制一直存在争议,直到2005年Stauderman等利用RNA干扰技术发现在抑制了一个名为基质交感分子（ stromal interaction molecule 1, STIM1）的基因后,使用毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）无法诱导胞外Ca2+内流证实STIM1是SOC的一种特异相关基因,相关实验进一步证实STIM1就是侦测内质网Ca2+含量的感应器介导SOC的调控。STIM1基因定位于人染色体11p15.5,是一种90kDa的Ⅰ型跨膜蛋白,主要存在于内质网,含有EF-hand结构域、SAM结构域、TM结构域、Coiled-coil结构域、ERM结构域、S/P结构域和Ploy-K结构域,当钙库内钙离子含量减少时,与EF-hand结构域结合的钙离子减少,STIM1以斑点形式堆积ER-PM区域并与细胞膜上的SOC相互作用从而调节SOC开放。鉴于SOC在缺氧性肺动脉高压的发病中起着十分重要的作用,而STIM1又在SOC的开启和关闭中起着关键作用,我们推测STIM1分子在缺氧引起的肺血管结构重塑和HPH的发生发展中发挥了作用。本实验观察了慢性高原缺氧大鼠肺血管结构重塑和STIM1表达的变化,并以离体培养的大鼠PASMCs为对象初步研究了STIM1在介导缺氧引起PASMCs增殖中的作用及其机制,不仅对深入理解HPH的发生机制具有重要的理论意义,而且可为临床防治HPH提供新的思路和靶点。1.成年雄性Wistar大鼠随机分为常氧对照组（N组）和慢性缺氧组（CH组）,将CH组置于小动物减压舱模拟海拔5000米高原低氧暴露21天,N组在舱外常氧环境饲养。测定各组大鼠平均肺动脉压（mPAP）及右室肥厚指数RV/（LV+S）。图像分析法测定肺小动脉管壁厚度指标即管壁厚度占血管外径的百分比（WT%）和管壁面积占血管总面积的百分比（WA%）,RTqPCR法检测各组远端肺动脉STIM1 mRNA表达量变化,免疫荧光双标检测STIM1蛋白在肺小动脉平滑肌层表达量变化。2.体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,分为常氧对照组（N）、低氧对照组（HCON）、低氧阴性siRNA组（HSiNT）及低氧阳性siRNA组（HSiSTIM1）。对照组不转染siRNA,SiNT组转染作为阴性对照的siRNA,SiSTIM1组转染针对大鼠STIM1基因的siRNA。转染采用脂质体反向转染法进行转染操作,每孔siRNA终浓度为90 nmol/L,转染24 h后去除转染液。低氧培养采用3%O2、92%N2和5%CO2,常氧培养采用21%O2、74%N2和5%CO2,培养时间为24 h。Westernblot验证干扰效果,MTT法和[3H]-TdR掺入法测定PASMCs细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,钙荧光测定细胞SOC介导的钙内流（store-operated calcium entry,SOCE）,免疫荧光法测定NFATc3核转位情况。结果:第一部分:1.与N组比较,CH组大鼠mPAP和RV/（LV+S）显著升高（P<0.05）。2.光镜下观察肺组织HE染色切片显示N组大鼠肺小动脉管壁较薄,管腔较大。CH组大鼠肺小动脉中膜平滑肌细胞显著增生,管壁明显增厚,管腔狭窄,出现了肺血管重塑现象。肺小动脉图像分析结果显示CH组WT% WA%均显著高于N组（P<0.05）。3.与N组相比,CH组大鼠远端肺动脉STIM1 mRNA表达显著升高（P<0.05）。4.免疫荧光双标法提示与N组相比,CH组大鼠肺小动脉平滑肌层STIM1蛋白表达显著增加（P<0.05）。第二部分:1.体外培养的大鼠PASMCs,呈平滑肌细胞特征性的“峰”、“谷”状生长,细胞呈梭形、三角形或多角形。兔抗大鼠α-SM-actin免疫荧光鉴定,胞质中可见绿色荧光,证实培养的细胞为PASMCs。2. Western bot实验结果显示,对照组、SiNT组和SiSTIM1组的STIM1/β-actin相对灰度值分别为（0. 624±0. 017）、（0. 618±0.021）和（0. 355±0. 008）。SiSTIM1组的STIM1蛋白表达水平较对照组和SiNT组显著降低（P<0.01）,而SiNT组的STIM1蛋白表达水平与对照组间无统计学差异（P>0.05）。表明转染特异性STIM1siRNA后能够显著地抑制STIM1基因的表达。3. HCON组、HSiNT组与N组相比增殖活性显著增高（P<0.05）,提示低氧刺激24 h可以使PASMCs增殖能力增强。HSiSTIM1组与HCON组、HSiNT组相比增殖活性显著降低（P<0.05）,HCON组与HSiNT组增殖活性无统计学差异（P>0.05）。提示STIM1基因沉默后PASMC缺氧增殖反应受到显著抑制。4. HCON组、HSiNT组与N组相比G0/G1期细胞比例显著降低（P<0.05）,提示缺氧可促使细胞进入有丝分裂期,促进PASMCs增殖,而HSiSTIM1组与HCON组、HSiNT组相比G0/G1期细胞比例显著增加（P<0.05）,HCON组与HSiNT组无统计学差异（P>0.05）。提示STIM1基因沉默能引起PASMCs G0/G1期阻滞。5. HCON组、HSiNT组与N组相比SOCE显著增加（P<0.05）,提示低氧可以增加PASMCs SOCE。HSiSTIM1组与HCON组、HSiNT组相比SOCE显著降低（P<0.05）,HCON组与HSiNT组SOCE无统计学差异（P>0.05）。提示STIM1基因沉默可以明显抑制低氧诱导的PASMCs SOCE的增加。6. HCON组、HSiNT组与N组相比NFATc3核转位增加（P<0.05）而HSiSTIM1组与HCON组、HSiNT组相比NFATc3核转位显著抑制（P<0.05）,HCON组与HSiNT组NFATc3核转位无显著差异（P>0.05）。提示缺氧能够促进PASMCs NFATc3核转位,STIM1基因沉默可以显著抑制缺氧诱导的NFATc3核转位。结论:1.模拟海拔5000m高原低氧暴露21天大鼠肺动脉压力显著升高并且出现肺血管重建和右心室肥厚等形态学改变。2.低氧暴露21天大鼠肺远端动脉STIM1 mRNA和肺小动脉平滑肌层STIM1蛋白表达显著增高,提示STIM1可能参与了慢性缺氧性肺血管重塑过程。3. RNA干扰沉默STIM1蛋白表达能够通过抑制PASMCs细胞膜上SOCE继而抑制NFATc3核转位从而抑制缺氧性PASMCs增殖反应。提示STIM1基因是缺氧通过SOC/Ca2+/NFATc3途径促进PASMCs增殖的关键环节,可望成为缺氧性肺动脉高压基因治疗的靶点。

全文目录


英文缩写一览表  4-5
英文摘要  5-9
中文摘要  9-13
前言  13-16
第一部分 缺氧性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌STIM1 的表达变化  16-28
  材料与方法  16-21
  实验结果  21-25
  讨论  25-27
  小结  27-28
第二部分 RNA 干扰沉默STIM1 表达对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及其机制探讨  28-46
  材料与方法  28-36
  实验结果  36-43
  讨论  43-45
  小结  45-46
全文总结  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-54
文献综述 钙库操纵性钙通道调控机制研究进展  54-63
  参考文献  58-63
在读期间发表的文章  63

相似论文

  1. Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
  2. 甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响,S433.4
  3. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  4. 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产,S435.32
  5. 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒力及两类靶标的分子克隆,S435.32
  6. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  7. MCFP对肝癌细胞生物行为学影响初步研究,R735.7
  8. Toll样受体4信号通路在脂多糖促进肺癌细胞增殖中的机制探讨,R734.2
  9. hnRNP A2/B1及p21WAF1蛋白在非小细胞肺癌中表达及意义,R734.2
  10. 半胱胺制剂对新生犊牛早期断奶成功率和免疫功能的影响,S823.5
  11. HIF-1α在犬体外循环缺血再灌注心肌胰岛素抵抗中的表达及意义,R654.1
  12. 兔脂肪来源干细胞分离培养及富血小板血浆对其增殖的影响,R329
  13. 大鼠再生肝脏细胞周期的研究,Q253
  14. 不同免疫方式对雏鸡免疫器官发育、细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响,S858.31
  15. 蟾蜍灵对血管内皮细胞EAhy926增殖和诱导凋亡的研究,R285
  16. 人参皂苷Rg1对优化培养的人脐血MSCs增殖、分泌功能与ERK、p38信号分子的影响,R285.5
  17. ROCK表达下调对PDGF介导的血管平滑肌细胞迁移、增殖的调控,R363
  18. As2O3对体外培养成骨细胞增殖与凋亡和BMP-2基因表达的影响,R363
  19. 缺氧预处理MSCs移植对心肌梗死区SDF-1/CXCR4轴表达变化的实验研究,R542.22
  20. MTD化疗联合节律化疗对乳腺癌血管生成和细胞增殖的研究,R737.9
  21. 虎纹捕鸟蛛粗毒对人结肠癌SW480细胞体外增殖的影响,R735.35

中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 肺原性心脏病
© 2012 www.xueweilunwen.com