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拮抗香蕉枯萎病菌的LX1菌株的分离鉴定及其抑菌蛋白的分离纯化与该基因的克隆

作　者: 卢娟
导　师: 王宇光
学　校: 海南大学
专　业: 农业生物技术
关键词: 香蕉枯萎病解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白分离纯化基因克隆
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

香蕉枯萎病的发生和流行,严重地威胁着香蕉产业的发展。鉴于长期使用化学药剂会造成环境污染及病虫害抗药性的产生等一系列问题的出现,而选育抗病品种也有着技术等种种困难,因此,生物防治成为环保、安全有效的防治香蕉枯萎病的途径。本研究目的从海南盐碱地土壤样品中筛选出对香蕉枯萎病有强烈抑制效果的菌种并探究其抗香蕉枯萎病菌的作用机制。主要研究结果如下：1.从海南不同的盐碱地中分离得到的153个菌种中,对它们进行拮抗香蕉枯萎病的活性检测,筛选出四个对香蕉枯萎病菌有较好的拮抗作用的菌株,其中有LX1菌株对香蕉枯萎病菌的抑制作用最佳。2.对LX1菌株进行常规生理生化鉴定、16S rRNA序列同源比较以及与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌部分特异性基因序列分析。最终将LX1菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。3.对LX1菌株的最佳生长条件确定,LX1菌株的最适生长温度为37℃、最适盐浓度为1%、最适PH为6.5。对LX1菌株的发酵上清液进行不同培养时间、温度和不同PH值处理,测定处理后的发酵上清液的抑菌活性,结果发现：在100℃时抑菌活性大大减少,这表明LX1菌株发酵上清液的活性物质可能为抑菌蛋白；PH为7时抑菌活性最大；培养时间为24h时的发酵上清液的抑菌效果最佳。4.蛋白粗提物对香蕉枯萎病菌有较强的抑制作用,而且与未经蛋白酶K处理的蛋白粗提物的抑菌效果相比,其抑菌圈明显的变小,由此说明,LX1菌株的蛋白粗提物中的抑菌物质对蛋白酶K敏感,进一步证明了LX1菌株的发酵上清液中的主要抑菌物质含有抑菌蛋白。5.用Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化LX1菌株的抑菌最佳的蛋白,用SDS-PAGE凝胶电泳检测到该蛋白基本得到纯化。把纯化的蛋白送到ProtTech公司测序。结果表明,该抑菌蛋白与Bacillus amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高。6.对该抑菌蛋白的基因进行克隆及序列测定,发现该蛋白基因的编码区有1041bp,编码346个氨基酸。将测序结果于NCBI中BLAST比对分析,结果表明抗菌蛋白核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸序列同源性达99%(有七个碱基差异)。抗菌蛋白氨基酸序列与Bacillus amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶氨基酸序列同源性达100%。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
1 前言  10-20
  1.1 香蕉枯萎病  10-11
    1.1.1 香蕉枯萎病菌的危害及分布  10
    1.1.2 香蕉枯萎病病原菌  10-11
  1.2 香蕉枯萎病发病症状及病菌致病机制  11-12
    1.2.1 香蕉枯萎病发病症状  11
    1.2.2 香蕉枯萎病菌致病机制  11-12
  1.3 香蕉枯萎病的生防菌的研究进展  12-15
    1.3.1 假单胞菌  13
    1.3.2 枯草芽孢杆菌  13-14
    1.3.3 木霉  14
    1.3.4 放线菌  14
    1.3.5 其他菌类  14-15
  1.4 解淀粉芽孢杆菌  15-18
    1.4.1 解淀粉芽孢杆菌的特性  15-16
    1.4.2 解淀粉芽孢杆菌的研究进展  16
    1.4.3 解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展  16
    1.4.4 解淀粉芽孢杆菌生防机制  16-18
      1.4.4.1 竞争作用  16-17
      1.4.4.2 拮抗作用  17
      1.4.4.3 诱导植物抗性作用  17
      1.4.4.4 促生作用  17-18
  1.5 本课题研究的意义和研究内容  18-20
    1.5.1 研究意义  18
    1.5.2 研究内容  18-19
    1.5.3 技术路线  19-20
2. 材料和方法  20-38
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 菌种  20
    2.1.2 培养基  20-21
    2.1.3 培养条件  21
    2.1.4 主要仪器设备  21-22
  2.2 实验方法  22-23
    2.2.1 拮抗香蕉枯萎病菌的菌株的分离筛选  22-23
      2.2.1.1 采集土样  22
      2.2.1.2 拮抗香蕉枯萎病菌菌株的初步分离筛选  22-23
      2.2.1.3 拮抗香蕉枯萎病菌菌株的复筛  23
  2.3 高效拮抗香蕉枯萎病菌的菌株鉴定  23-27
    2.3.1 生理生化鉴定  23-25
    2.3.2 分子鉴定  25-27
  2.4 LX1菌株发酵上清液稳定性的研究  27-28
    2.4.1 菌株发酵上清液的制备  27
    2.4.2 发酵上清液的活性测定  27-28
    2.4.3 不同的处理对LX1菌株产生抑菌活性物质的影响  28
  2.5 LX1菌株抗菌蛋白粗提物活性成分的初步研究  28-33
    2.5.1 抗菌蛋白粗提物的提取  28-29
    2.5.2 抗菌蛋白粗提物活性测定  29-30
    2.5.3 抗菌蛋白对蛋白酶K的敏感性试验  30
    2.5.4 抗菌蛋白的分离纯化  30-31
      2.5.4.1 Sephacry1 S-200HR柱层析  30-31
      2.5.4.2 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析  31
    2.5.5 目标蛋白分子量的测定  31-33
      2.5.5.1 电泳溶液的配制  31-32
      2.5.5.2 电泳凝胶的制备  32-33
      2.5.5.3 电泳方法  33
      2.5.5.4 凝胶染色与脱色  33
  2.6 抗菌蛋白的质谱分析  33-34
  2.7 抗菌蛋白基因的克隆  34-37
    2.7.1 LX1菌株基因组DNA的提取  34
    2.7.2 引物的设计  34
    2.7.3 PCR扩增  34
    2.7.4 PCR产物的回收  34
    2.7.5 纯化PCR产物加"A"  34-35
    2.7.6 与T载体连接  35
    2.7.7 大肠杆菌感受态的制备  35
    2.7.8 转化  35-36
    2.7.9 阳性克隆的筛选及鉴定  36-37
  2.8 阳性克隆菌株序列测定  37-38
3. 结果与分析  38-54
  3.1 拮抗香蕉枯萎病菌菌株的分离筛选  38
  3.2 LX1菌株的鉴定  38-46
    3.3 LX1菌株产抗菌物质的研究  43-46
      3.3.1 LX1菌发酵上清液抑菌活性测定结果  43
      3.3.2 温度对发酵上清液抑菌活性的影响  43-45
      3.3.3 pⅡ对发酵上清液抑菌活性的影响  45
      3.3.4 培养时间对发酵上清液抑菌活性的影响  45-46
  3.4 抗菌蛋白粗提物的抑菌活性测定结果  46-47
  3.5 抗菌蛋白对蛋白酶K的敏感性试验结果  47-48
  3.6 抗菌蛋白的分离纯化  48-50
    3.6.1 Sephacry1 S-200HR柱层析  48-49
    3.6.2 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析  49-50
  3.7 抗菌蛋白的质谱分析  50
  3.8 抗菌蛋白基因的克隆  50-54
    3.8.1 抗菌蛋白基因的扩增  50
    3.8.2 阳性克隆菌株的鉴定  50-51
    3.8.3 阳性克隆基因测序与分析  51-54
4. 讨论  54-57
  4.1 芽孢杆菌生防作用  54
  4.2 LX1菌株鉴定  54-55
  4.3 LX1菌株特性  55
  4.4 抗菌蛋白的分离纯化  55
  4.5 抗菌蛋白的基因克隆  55-56
  4.6 展望  56-57
5. 结论  57-58
参考文献  58-66
附录  66-68
  附录1  66-67
  附录2  67-68
缩略词  68-69
致谢  69

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