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性激素对奶牛输卵管上皮细胞前列腺素受体表达的调控作用

作　者: 付改玲
导　师: 曹金山
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 前列腺素化合物 前列腺素受体 雌激素 孕激素 输卵管上皮细胞 Elisa技术 实时荧光定量RT-PCR
分类号: S823.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:为进一步研究奶牛输卵管中前列腺素类化合物及其受体的生殖生理作用提供可靠的实验依据和理论基础,本文分析研究了奶牛输卵管上皮细胞前列腺素受体种类及性激素（雌激素和孕酮）对这些受体表达的调控作用。方法:1)应用体外细胞培养技术培养奶牛输卵管上皮细胞。2)分别用不同浓度(10-9～10-5mol/L)的前列腺素类化合物（PGE2、PGD2、butaprost）作用于第三代传代输卵管上皮细胞,然后应用Elisa技术检测奶牛输卵管上皮细胞中第二信使cAMP含量的变化。3)分别用不同浓度(10-12～10-8mol/L)雌激素和孕激素,按4h和24h作用传代的第三代输卵管上皮细胞,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测奶牛输卵管上皮细胞中前列腺素类受体的种类及其mRNA表达的变化。4)雌激素受体阻断剂和孕激素受体阻断剂分别与相应的受体激素共同作用于细胞,通过荧光定量RT-PCR技术进一步证实性激素（E2和P4）对奶牛输卵管上皮细胞中前列腺素受体表达的调控作用。结果:首先,成功培养获得了奶牛输卵管上皮细胞的原代细胞和传代细胞,且第三代细胞生长良好,可用于上皮细胞中cAMP量和前列腺素受体mRNA表达的检测。其次,PGE2、PGD2和butaprost对上皮细胞的处理后,细胞中cAMP含量发生显著的变化,且PGE2、PGD2和butaprost可浓度依存性的升高cAMP含量,证明奶牛输卵管上皮细胞中存在前列腺素受体EP2、EP4和DP受体。最后,雌激素和孕激素对奶牛输卵管上皮细胞前列腺素受体mRNA表达的调控作用的实验结果表明,奶牛输卵管上皮细胞中存在前列腺素受体EP1、EP2、EP3、EP4、FP和TP受体。此外,低浓度(10-12mol/L)的雌激素和孕激素对奶牛输卵管上皮细胞中前列腺素受体mRNA的表达具有调控作用。结论:奶牛输卵管上皮细胞中存在前列腺素受体EP1、EP2、EP3、EP4、FP和TP受体。雌激素和孕激素对前列腺素类受体的表达具有调控作用,提示在奶牛输卵管上皮细胞性激素-前列腺素-前列腺素受体发挥重要的生殖生理作用。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
1 前言  7-22
  1.1 前列腺素类化合物  7-11
  1.2 前列腺素类受体  11-13
  1.3 输卵管  13-16
    1.3.1 输卵管结构  13
    1.3.2 输卵管的作用  13-15
    1.3.3 前列腺素化合物对输卵管的作用  15-16
  1.4 性激素的作用  16-21
    1.4.1 雌激素的作用  17
    1.4.2 孕酮的作用  17-18
    1.4.3 性激素在生殖生理中的研究  18-21
  1.5 研究目的与意义  21-22
2 实验材料与方法  22-29
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 实验材料  22
    2.1.2 实验试剂  22-23
    2.1.3 实验仪器  23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 奶牛输卵管上皮细胞原代培养  23
    2.2.2 奶牛输卵管上皮细胞传代培养  23-24
    2.2.3 奶牛输卵管上皮细胞cAMP 量的测定  24-25
      2.2.3.1 cAMP 的提取  24
      2.2.3.2 cAMP 吸光值的测定  24-25
    2.2.4 奶牛输卵管上皮细胞中前列腺素受体mRNA 表达的测定  25-28
      2.2.4.1 前列腺素受体表达与性激素（E_2、P_4）作用时间、浓度的关系  25
      2.2.4.2 雌激素受体阻断剂和雌激素对奶牛输卵管上皮细胞的处理  25
      2.2.4.3 孕酮激素受体阻断剂和孕酮对奶牛输卵管上皮细胞的处理  25
      2.2.4.4 总RNA 的提取  25-26
      2.2.4.5 反转录cDNA  26
      2.2.4.6 实时荧光定量PCR  26-27
      2.2.4.7 实时荧光定量PCR 检测前列腺素受体表达的方法  27-28
    2.2.5 基因克隆与测序  28-29
      2.2.5.1 PCR 产物的纯化  28
      2.2.5.2 PCR 产物与pMD-19 Vetor 载体的连接  28
      2.2.5.3 连接产物的转化  28-29
      2.2.5.4 核苷酸序列测定与分析  29
    2.2.6 数据处理  29
3 实验结果  29-45
  3.1 奶牛输卵管上皮细胞中cAMP 含量的检测  29-30
    3.1.1 cAMP 标准曲线  29
    3.1.3 PGE_2、PGD_2、butaprost 对上皮细胞中cAMP 量的影响  29-30
  3.2 奶牛输卵管上皮细胞中前列腺素受体mRNA 表达结果  30-42
    3.2.1 总RNA 提取  30-31
    3.2.2 实时荧光定量PCR 产物的鉴定  31
    3.2.3 线性分析及特异性检测  31-33
      3.2.3.1 扩增效率曲线分析  31-32
      3.2.3.2 扩增及溶解曲线分析  32-33
    3.2.4 E_2对前列腺素受体mRNA 相对表达量的影响  33-37
      3.2.4.1 E_2不同时间、浓度对前列腺素受体mRNA 相对表达量的影响  33-36
      3.2.4.2 雌激素受体阻断剂对E_2介导的前列腺素受体mRNA 表达量的影响  36-37
    3.2.5 P_4对前列腺素受体基因mRNA 相对表达量的影响  37-42
      3.2.5.1 P_4不同时间、浓度对前列腺素受体mRNA 相对表达量的影响  37-40
      3.2.5.2 孕激素受体阻断剂对P_4介导的前列腺素受体mRNA 表达量的影响  40-42
  3.3 基因克隆测序的结果  42-45
4 讨论  45-48
5 结论  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-62
作者简介  62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛 > 各种用途牛 > 乳用
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