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内皮细胞中的雌激素受体在单核细胞与内皮细胞之间粘附作用中的研究

作　者: 赵媛媛
导　师: 王林
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: 人脐静脉内皮细胞雌激素受体-alpha 雌激素受体-beta 动脉粥样硬化 THP-1 粘附率
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：通过体外分离、培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),建立血管内皮细胞(VEC)的体外培养模型,为研究VEC提供了可靠的实验手段；检测HUVECs中雌激素受体两个亚型ERa和ERβ的表达差异；并进一步揭示内皮细胞中的ERα、ERβ对动脉粥样硬化形成的初始过程——单核细胞(THP-1)与HUVECs之间粘附的影响。方法：无菌条件下剪取新生儿脐带(约20cm-30cm),采用胶原酶Ⅱ灌流消化法进行原代HUVECs的体外分离、培养,并进行消化传代,将2-4代细胞进行冻存,定期复苏,以保持实验细胞的同源同代性,分别从细胞形态学、Ⅷ因子相关抗原免疫组化及表面抗原CD34的检测进行内皮细胞的鉴定。采用2-4代的HUVECs,通过western blot及RT-PCR从蛋白水平和mRNA水平分别对HUVECs进行雌激素受体(ERα、ERβ)相对表达的检测。用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000向HUVECs转染质粒(pWPI-flag-hERa, pWPI-flag-ERβ, PsuperiorERasiRNA, PsuperiorERβsiRNA, pWPI-vector, pLVTHM-scramble),48小时后,分别与相同数目的THP-1(用绿色荧光染料染色)进行共培养1.5h,共分为六组：ERa+组HUVEC (ERα+)与THP-1, ERα-组HUVEC (ERα-)与THP-1; ERβ+组HUVEC (ERβ+)与THP-1, ERβ-组HUVEC (ERβ-)与THP-1, Ve组HUVEC (Ve)与THP-1, Sc组HUVEC (Sc)与THP-1。荧光显微镜下观察并比较各组两种细胞之间的粘附情况。结果：①倒置显微镜下观察HUVECs的体外生长特点,原代培养的HUVECs 3～5小时开始贴壁,48-72h细胞生长最快,呈对数生长,胞质丰富,胞核清晰可见,5-7d细胞生长融合呈单层“铺路石”样镶嵌排列。传代细胞与原代细胞相比贴壁时间早,生长更旺盛,但细胞形态极为相似。Ⅷ因子相关抗原染色96%以上的内皮细胞呈阳性,表面抗原CD34的阳性率高达89.38%,提示细胞纯度高,且证实分离培养的细胞为HUVECs;②estern blot及RT-PCR的相对定量结果均显示在HUVECs中ERp的表达高于ERa的表达,差异具有统计学意义(t=-15.626,P<0.01；t=-3.995,P<0.05),与以往的研究结果相一致；③比较THP-1与基因转染后HUVECs之间的粘附情况显示：ERa+组两种细胞之间的粘附率较对照组Ve组细胞之间的粘附率明显降低,差异具有统计学意义(t=-47.117,P<0.01); ERα-组单核细胞和内皮细胞之间的粘附率较对照组Sc组明显升高,差异具有统计学意义(t=48.111,P<0.01); ERβ+组与ERβ-组两种细胞之间的粘附率较对照组Ve组及Sc组无明显差异(t=2.64, P>0.05; t=-0.564, P >0.05).结论：①原代HUVECs的体外分离、培养、冻存、复苏及鉴定方法成熟可靠、简便易行,为进行VEC的体外研究提供了理想的实验方法和材料；②目前已知雌激素受体主要存在两种亚型ERa和ERβ,两者在体内分布极其广泛,虽然结构相似,但在不同组织中ERα和ERβ的优势表达不同,发挥的作用也不尽相同,其中本研究结果显示在HUVECs中ERβ的表达高于ERa的表达；③在单核细胞向内皮细胞的迁移、粘附的过程中,HUVECs中ERa过表达后可明显抑制THP-1与HUVECs之间的粘附,而ERβ的作用并不明显,为动脉粥样硬化的早期临床干预治疗提供了新的理论依据及思路。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语/符号说明  10-12
前言  12-16
  研究现状、成果  12-14
  研究目的、方法  14-16
一、人脐静脉内皮细胞的分离、培养及鉴定  16-25
  1.1 对象和方法  16-21
    1.1.1 标本采集  16
    1.1.2 实验试剂  16
    1.1.3 相关实验仪器  16-17
    1.1.4 试剂配制  17-18
    1.1.5 方法  18-21
  1.2 结果  21-22
    1.2.1 HUVECs冻存后复苏  21
    1.2.2 HUVECs的鉴定  21-22
  1.3 讨论  22-24
    1.3.1 HUVECs成功分离、培养的影响因素  23
    1.3.2 内皮细胞的特征性标志-vWF、CD34  23-24
  1.4 小结  24-25
二、人脐静脉内皮细胞雌激素受体亚型的表达  25-37
  2.1 对象和方法  25-33
    2.1.1 实验试剂  25-26
    2.1.2 主要实验仪器  26
    2.1.3 相关试剂配制  26
    2.1.4 实验方法  26-32
    2.1.5 统计学处理  32-33
  2.2 结果  33-35
    2.2.1 ERα、ERβ蛋白水平的表达  33-34
    2.2.2 RNA的纯度  34
    2.2.3 ERα、ERβ mRNA水平的表达  34-35
  2.3 讨论  35-36
  2.4 研究局限性  36
  2.5 小结  36-37
三、内皮细胞中的雌激素受体在单核细胞与内皮细胞之间粘附作用中的研究  37-44
  3.1 对象和方法  37-38
    3.1.1 材料、试剂  37
    3.1.2 实验仪器  37
    3.1.3 方法  37-38
    3.1.4 统计学处理  38
  3.2 结果  38-40
    3.2.1 ERα、ERβ敲低或过表达的检测  38-39
    3.2.2 ER对THP-1与HUVECs之间粘附的影响  39-40
  3.3 讨论  40-42
    3.3.1 细胞转染技术  40-41
    3.3.2 单核细胞与内皮细胞的粘附  41-42
    3.3.3 雌激素受体与AS  42
  3.4 小结  42-44
结论  44-45
参考文献  45-50
发表论文和参加科研情况说明  50-51
综述雌激素及其受体与动脉粥样硬化  51-58
  综述参考文献  55-58
致谢  58

内皮细胞中的雌激素受体在单核细胞与内皮细胞之间粘附作用中的研究

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