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人牙髓细胞向成牙本质细胞方向诱导分化相关miRNA的筛选

作　者: 杨明聪
导　师: 向学熔
学　校: 重庆医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 人牙髓细胞 miRNA 成牙本质细胞分化
分类号: R781.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景microRNAs(miRNAs)是小的非编码RNA,长度约20~22bp,由基因组转录,通过和靶基因mRNA碱基配对,引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从而在转录水平调控蛋白表达。作为机体内源性RNA,同时作为可对基因表达进行微调的分子,其可能参与了生物体的生长、发育、衰老及死亡的调控,近年来其在细胞增殖及分化中的意义引起广泛关注。miRNA在多种细胞中均有表达,它通过负向调节细胞中某些关键基因的表达,对细胞的分化起调控作用[1.2.3]。牙髓组织在牙齿的营养代谢、感觉、修复等生理功能方面发挥着重要的作用,深入研究牙髓,有助于我们了解牙髓细胞的分化、牙髓钙化、牙本质形成以及相关的调节因素。牙髓细胞经诱导可向成牙本质细胞分化并形成牙本质样结构,预示了其在牙本质再生中作为种子细胞的应用前景。目的通过检测牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中miRNA基因的表达谱,筛选出诱导分化前后细胞表达的差异性miRNAs,并预测其可能靶基因,寻找可能的人牙髓细胞成牙本质分化特异性的miRNAs,并进行验证,为进一步探讨miRNAs对HDPCs生物学功能的调控作用提供实验基础。材料与方法(1)采用酶消化法+组织块法分离培养人牙髓细胞,通过观察原代及传代HDPCs的形态特点,免疫化学检测细胞表面标志物,对人牙髓细胞进行鉴定;(2)采用地塞米松、b甘油磷酸钠和维生素C联合诱导HDPCs向成牙本质细胞方向分化,检测其碱性磷酸酶活性;(3)利用miRNA基因芯片技术,检测了人牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中miRNAs的表达谱,分析并筛选在HDPCs分化过程中差异表达的miRNA,并通过miRGen数据库预测其靶基因;(4)采用半定量RT-PCR的方法,对miRNA基因芯片筛选出的人DPCs及其诱导分化的成牙本质细胞的差异miRNA进行验证。结果(1)经酶消化法+组织块法联合培养所得的细胞,细胞表型免疫组化鉴定:波形蛋白、I型胶原表达阳性。(2)牙髓细胞在含地塞米松、?-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基中可诱导分化为成牙本质细胞,形成钙化结节,碱性磷酸酶活性检测升高,钙化结节Von Kossa染色阳性表达。(3)利用基因芯片检测了人DPCs及其诱导分化的成牙本质细胞miRNAs的表达谱,筛选了差异表达的miRNAs,矿化诱导的HDPC较未诱导HDPC的表达谱比较,有72种miRNA发生1.5倍以上表达上调,61种miRNA发生1.5倍以上表达下调。(4)对筛选出的差异表达miRNAs通过miRNA靶标预测工具分析发现,带有靶标基因的miRNA有35个,35个miRNA的靶标基因总和1327个,miRNA和靶标基因关系对总共2158个。(5)选择hsa-miR-150用半定量RT-PCR进行验证,结果与芯片结果一致。结论(1)用组织块酶消化法可从人牙髓中分离得到人牙髓细胞,并可在体外培养将其诱导分化为成牙本质细胞。(2)在人牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中均存在大量的miRNAs。(3)在人牙髓细胞及其诱导分化的成牙本质细胞中存在差异表达的miRNAs,它们可能对牙髓细胞的成牙本质分化起着重要的调控作用,即存在所谓的特异性miRNA.

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