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精氨酸激酶在棉铃虫中的表达及调控研究

作　者: 苏晓峰
导　师: 程红梅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉铃虫精氨酸激酶启动子克隆 Real Time-PCR RNAi 生理测定
分类号: S435.622.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是世界性重要的农业害虫,分布广泛。它不仅对棉花造成严重危害,还取食玉米、高粱、大豆等多种农作物。精氨酸激酶(arginine kinase,AK)作为无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,研究表明该酶在适应不良环境因子、免疫及防御病原侵袭等过程中也发挥了重要作用。本文以对Bt敏感的棉铃虫品系(96S)为材料,克隆其精氨酸激酶基因及启动子序列,并利用RNAi技术,研究AK在棉铃虫发育过程中的作用。同时以室内用Cry1Ac筛选75代产生2971倍抗性的棉铃虫品系(Bt-R)为材料,研究了AK在其体内的表达情况,还对两个不同品系的棉铃虫进行了抗性相关基因及生理指标测定,分析它们之间存在的差异。本文的主要研究结果如下:1、利用同源序列信息比对,克隆获得96S品系的AK基因,发现基因内部含有两个外显子和两个内含子,构建原核表达载体并优化表达条件,得到单一可溶性的目的蛋白;2、利用Genome Walking,对96S品系AK基因启动子进行克隆,向5’非翻译区上游延伸约2Kb,并进行了生物学功能预测;3、利用Real-Time PCR,对96S品系的AK基因表达量进行分析,发现它表达部位广泛,且存在时空特异性表达,在对能量需求量大的中肠部位表达量最高。在棉铃虫幼虫期,AK基因表达量随着龄期的增长而增加;而进入成虫期,AK基因表达量明显下降;4、利用饲喂及注射两种方法,成功干扰96S棉铃虫AK基因的正常表达。与正常组相比,干扰组棉铃虫生长发育受到明显抑制,出现发育延缓现象。这一现象与生理指标测定和生态学统计结果相符;5、利用RT-PCR和Real-Time PCR,对Bt-R棉铃虫品系的AK基因表达量进行分析,发现它表达量存在时空特异性表达,并随着龄期的增长而增加。与96S棉铃虫品系相比,在不同龄期和组织中,AK表达量发生了明显的变化;6、对96S和Bt-R两个棉铃虫品系进行生理指标测定,发现:与96S品系相比,在Bt-R品系中,血淋巴中可溶性蛋白含量明显上升,说明其体内的抗性能力得到了显著增强;精氨酸激酶和碱性磷酸酯酶活性明显下降。与同品系肌肉中的酶活相比,中肠内的酶活均表现出较高的活性。本实验在分子层面上对AK基因及其表达和AK蛋白表达进行了研究,并在棉铃虫生理方面进行了的探索。这有利于棉铃虫AK分子水平的研究,并为棉铃虫的防治提供了理论基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章文献综述  14-24
  1.1 精氨酸激酶研究进展  14-18
    1.1.1 精氨酸激酶蛋白性质  14-15
    1.1.2 精氨酸激酶的拷贝数及特异性表达  15-16
    1.1.3 精氨酸激酶与免疫力及抗性的关系  16-17
    1.1.4 精氨酸激酶与过敏源之间的关系  17
    1.1.5 外界物质对精氨酸激酶的影响  17
    1.1.6 精氨酸激酶与肌酸激酶的关系  17-18
    1.1.7 精氨酸激酶在物种分类中的作用  18
  1.2 棉铃虫防治工作的研究进展  18-21
    1.2.1 棉铃虫简介  18-19
    1.2.2 Bt 毒素的作用机制  19
    1.2.3 棉铃虫对Bt 毒素的抗性研究进展  19-21
    1.2.4 棉铃虫相关解毒酶的研究进展  21
  1.3 精氨酸激酶在农业防治中的研究  21-22
  1.4 本文的目的、意义和技术路线  22-24
    1.4.1 目的和意义  22-23
    1.4.2 技术路线  23-24
第二章精氨酸激酶基因的克隆及表达  24-35
  2.1 材料与方法  24-30
    2.1.1 实验材料与试剂  24
    2.1.2 实验方法  24-30
  2.2 结果与分析  30-33
    2.2.1 AK 基因的克隆  30
    2.2.2 AK 蛋白表达载体（pET32a-AK）的构建及验证  30-31
    2.2.3 不同诱导时间下AK 融合蛋白的表达情况  31-32
    2.2.4 不同浓度的IPTG 对AK 融合蛋白表达的影响  32-33
  2.3 讨论  33-35
第三章精氨酸激酶启动子的克隆  35-43
  3.1 实验材料和方法  35-38
    3.1.1 实验材料  35
    3.1.2 实验试剂  35
    3.1.3 实验方法  35-38
  3.2 结果与分析  38-41
    3.2.1 棉铃虫DNA 的提取  38
    3.2.2 基因组步移结果  38-39
    3.2.4 AK 基因的序列信息  39-41
  3.3 讨论  41-43
第四章精氨酸激酶表达的荧光定量分析  43-48
  4.1 实验材料和方法  43-44
    4.1.1 实验材料  43
    4.1.2 试剂  43
    4.1.3 实验方法  43-44
  4.2 结果与分析  44-46
    4.2.1 荧光定量反应程序的优化  44-45
    4.2.2 荧光定量标准曲线的建立  45-46
    4.2.3 棉铃虫AK 表达的荧光定量分析  46
  4.3 讨论  46-48
第五章棉铃虫精氨酸激酶的 RNAi 分析  48-60
  5.1 实验材料和方法  48-51
    5.1.1 实验材料  48
    5.1.2 试剂  48
    5.1.3 相关溶液的配制  48-49
    5.1.4 实验方法  49-51
  5.2 结果与分析  51-58
    5.2.1 RNAi 载体及表达菌株的相关信息  51
    5.2.2 干扰AK 基因载体（RNAi-AK）的构建与验证（饲喂法）  51-52
    5.2.3 转RNAi-AK 菌株RNA 的提取（饲喂法）  52-53
    5.2.4 棉铃虫的饲养及取食细菌与否的鉴定  53
    5.2.5 取食RNAi-AK 菌株后棉铃虫AK 表达量分析  53-54
    5.2.6 取食RNAi-AK 菌株后棉铃虫生态学观测  54-55
    5.2.7 RANi-AK 的构建与验证（注射法）  55-56
    5.2.8 dsRNA 体外的大量合成  56-57
    5.2.9 棉铃虫注射dsRNA 的部位  57
    5.2.10 注射RANi-AK 后AK 表达量分析  57-58
  5.3 讨论  58-60
第六章精氨酸激酶及抗性相关基因表达量分析  60-66
  6.1 实验材料和方法  60
    6.1.1 实验材料  60
    6.1.2 实验试剂  60
    6.1.3 实验方法  60
  6.2 结果与分析  60-64
    6.2.1 不同棉铃虫品系相关抗性基因指数扩增期的确定  60-61
    6.2.2 不同棉铃虫品系抗性相关基因表达量分析  61-62
    6.2.3 96S 和Bt-R 棉铃虫品系中AK 的荧光定量分析  62-63
    6.2.4 干涉AK 后96S 棉铃虫品系抗性相关基因的表达量分析  63-64
  6.3 讨论  64-66
第七章生理指标测定  66-72
  7.1 实验材料和方法  66-69
    7.1.1 实验材料  66
    7.1.2 实验试剂  66
    7.1.3 实验方法  66-69
  7.2 结果与分析  69-70
    7.2.1 96S 和Bt-R 棉铃虫品系血淋巴中可溶蛋白含量的测定  69
    7.2.2 96S 和Bt-R 棉铃虫品系AK 活力的测定  69-70
    7.2.3 96S 和Bt-R 棉铃虫品系ALP 活性的测定  70
  7.3 讨论  70-72
第八章结论  72-74
参考文献  74-82
致谢  82-83
作者简历  83

精氨酸激酶在棉铃虫中的表达及调控研究

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