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小鼠甲状腺过氧化物酶Phe~(473)-Ala~(800)多肽的表达与纯化

作　者: 李仁宏
导　师: 闫玉文
学　校: 河北医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 自身免疫性甲状腺炎 mTPOF473-A800 原核表达 GST柱纯化 pGEX-6p-1
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroditis）又称桥本氏甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis, HT）是常见的器官特异性自身免疫病。甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase, TPO）是甲状腺激素合成的关键催化酶,也是建立HT的小鼠模型—实验性自身免疫性甲状腺炎（experimental autoimmune thyroiditis, EAT）的抗原。EAT模型是诱导动物甲状腺的炎症,模拟人的自身免疫性甲状腺炎,最常用的是小鼠模型,尤其是H-2k和H-2s单元型小鼠等有较重的甲状腺浸润,能更好的反应甲状腺炎的状况。甲状腺过氧化物酶（TPO）是一种糖基化血红素蛋白,跨于甲状腺细胞顶缘的细胞膜上,是甲状腺激素合成的关键酶,也是引起自身免疫性甲状腺炎的一个重要自身抗原,TPO表位的异常表达或TPO和TPO抗体（TPOAb）的免疫反应,常是引起HT患者甲状腺细胞损伤的重要机制。本实验旨在通过原核表达系统,表达和纯化小鼠甲状腺过氧化物酶Phe473-Ala800多肽(mouse thyroid peroxidase,mTPOF473-A800)。目的:构建重组小鼠过氧化物酶多肽(mTPOF473-A800)原核表达载体,在Rosseta菌中诱导表达,纯化mTPOF473-A800蛋白。方法:1提取甲状腺组织RNA。取6只C57BL/6小鼠的甲状腺组织,约60mg,液氮冷冻,研钵研磨组织,提取总RNA。2扩增目的基因。RT-PCR法扩增mTPOF473-A800基因3克隆载体的构建。mTPOF473-A800基因与pEASY-T3克隆载体连接,将连接产物转化DH5a感受态细胞,加入含80ug/ml氨苄青霉素的LB培养基,37℃过夜培养,次日取1ul菌液做菌液PCR,初步筛选阳性菌株。将阳性菌液作质粒小提,质粒经EcoRI/XhoI双酶切鉴定,挑选阳性的重组克隆载体10ul送华大基因公司测序。4重组表达载体的构建。pEASY-T3-mTPOF473-A800载体、pET28a、pET32a和pGEX-6p-1做EcoRI/XhoI双酶切,后胶回收所需要的片段,经DNA连接酶做连接反应,将连接产物转化DH5α感受态细胞,次日取1ul菌液做菌液PCR,初步筛选阳性菌株。将阳性菌液作质粒小提,质粒经EcoRI/XhoI双酶切鉴定,挑选阳性的重组表达载体转化E.coli Rosseta感受态细胞,做诱导表达,筛选表达量高的重组表达载体,后进行表达条件的优化。5 pGEX-6p-1- mTPOF473-A800的表达和GST柱纯化。在最优化的条件诱导表达GST-mTPOF473-A800融合蛋白,经GST柱纯化,得到mTPOF473-A800蛋白。结果:1提取总RNA,RT-PCR PCR扩增目的基因(mTPOF473-A800基因),后连接到pEASY-T3克隆载体,测序结果显示扩增的mTPOF473-A800基因序列正确。2重组表达载体的构建与表达条件的优化。通过双酶切鉴定,mTPOF473-A800基因成功连接3个表达载体。构建成功的重组表达载体转化E.coli Rosseta感受态细胞,经诱导表达,pGEX-6p-1- mTPOF473-A800高效表达mTPOF473-A800蛋白,且可溶性较高。最佳诱导条件是:30℃、1mM IPTG。3 pGEX-6p-1- mTPOF473-A800大量表达和纯化。采用Western blotting鉴定蛋白表达产物,经GST柱纯化,SDS-PAGE电泳显示清晰的GST条带和mTPOF473-A800条带。结论:构建pGEX-6p-1-mTPOF473-A800原核表达载体,并在Rosseta菌诱导表达了GST- mTPOF473-A800融合蛋白,GST柱纯化获得mTPOF473-A800蛋白。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9
材料与方法  9-25
结果  25-28
附图  28-35
讨论  35-40
结论  40
参考文献  40-45
综述 自身免疫性甲状腺炎研究进展  45-53
  参考文献  50-53
致谢  53-54
个人简历  54

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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