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单核苷酸的制备及分离

作　者: 周文晓
导　师: 刘建军
学　校: 山东轻工业学院
专　业: 发酵工程
关键词: 啤酒酵母核糖核酸(RNA) 5’-磷酸二酯酶 5’-核苷酸离子交换柱层析分离
分类号: Q524
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

5’-核苷酸是核糖核酸的水解产物,在食品、医药、农业等领域具有广阔的应用前景,因此研究开发经济可行的核苷酸生产方法已经引起人们的广泛关注。本课题对酶法降解核糖核酸以及离子交换层析法分离核苷酸的工艺条件进行了研究,建立了酶解降解核糖核酸和离子交换层析法分离核苷酸的工艺技术路线。对酶解法生产核苷酸工艺条件进行了研究,考察了底物浓度、酶加量、反应温度、酶解时间、酶解反应pH等对酶解率的影响,确定了5’-磷酸二酯酶水解核糖核酸的工艺参数:核糖核酸浓度为1%,酶加量为35u/gRNA,水解温度为65℃,核糖核酸溶液初始pH为5.2,酶解反应时间为48h。在以上水解条件下,酶解反应最完全,RNA的酶解率达到了85.60%。研究了阳离子交换层析法分离5‘-核苷酸工艺条件,考察了核苷酸上样pH、上样量、洗脱剂、洗脱流速等因素对核苷酸分离的影响,确定了阳离子交换层析法对核苷酸初步分离的工艺条件:核苷酸溶液的上样pH值为2.0,上样量为1.0g/L树脂,洗脱液采用蒸馏水,洗脱液流速为0.15BV/h。在以上层析条件下经过两次层析分离,可实现四种5‘-核苷酸初步分离,其中5’-GMP,5’-AMP,5’-CMP的纯度分别达到了:96.9%,93.65%,94.78%,对应的收率分别为89.16%,83.24%,81.39%,5’-UMP的纯度仅为76.40%,需进一步分离纯化。论文研究了阴离子交换层析法分离纯化5’-UMP工艺条件,考察了5’-UMP上样pH、洗脱液等关键因素对5’-UMP纯化分离的影响,确定了阴离子交换层析法分离纯化5’-UMP的工艺条件:调节溶液pH为1.5,以1.0g/L树脂的上样量上样,采用pH4.0的盐酸溶液以为0.15BV/h的流速洗脱,分离纯化得到纯度为87.65%的5’-UMP溶液。

全文目录

摘要  9-10
ABSTRACT  10-11
第1章绪论  11-27
  1.1 核苷酸的简介  11-14
    1.1.1 核苷酸的种类  11
    1.1.2 5’-核苷酸的的结构  11-12
    1.1.3 核苷酸的理化性质  12-13
    1.1.4 核苷酸的发展简史  13-14
  1.2 核苷酸的功能及应用  14-19
    1.2.1 核苷酸的功能  14-16
      1.2.1.1 核苷酸对机体免疫的调节作用  14
      1.2.1.2 核苷酸对肠道的作用  14-15
      1.2.1.3 核苷酸对肝脏代谢的作用  15
      1.2.1.4 核苷酸对大脑的作用  15-16
    1.2.2 核苷酸的应用  16-19
      1.2.2.1 核苷酸在食品领域的应用  16-17
      1.2.2.2 核苷酸在医药领域的应用  17-18
      1.2.2.3 核苷酸在动物饲料方面的应用  18
      1.2.2.4 核苷酸在农业方面的应用  18-19
      1.2.2.5 核苷酸在化妆品方面的应用  19
  1.3 核苷酸的生产方法  19-21
    1.3.1 化学合成法  19
    1.3.2 微生物发酵法  19
    1.3.3 生物催化法  19-20
    1.3.4 酶解法  20-21
  1.4 酶解法生产核苷酸技术的研究现状  21-25
    1.4.1 5’-磷酸二酯酶的来源  21-23
    1.4.2 核酸的酶解  23
    1.4.3 核苷酸分离纯化研究现状  23-25
  1.5 课题的立题背景及研究的目的意义  25
  1.6 课题的主要研究内容  25-27
    1.6.1 核酸酶解工艺条件的研究  25
    1.6.2 阳离子交换层析法分离核苷酸工艺条件的研究  25
    1.6.3 阴离子交换层析法分离纯化5’-UMP 工艺条件的研究  25-27
第2章酶解法生产核苷酸工艺条件的研究  27-41
  2.1 引言  27
  2.2 材料与方法  27-35
    2.2.1 实验试剂  27-28
    2.2.2 实验器材  28-29
    2.2.3 实验方法  29-35
      2.2.3.1 紫外吸收法测定RNA 的含量  29
      2.2.3.2 定磷法测定RNA 的含量  29-31
      2.2.3.3 过碘酸氧化法测定5’-核苷酸含量  31-34
      2.2.3.4 5’-磷酸二酯酶酶活的测定  34-35
      2.2.3.5 酶解收率的计算  35
  2.3 结果与讨论  35-39
    2.3.1 核酸样品中RNA 含量的确定  35
    2.3.2 5‘-磷酸二酯酶水解核酸的工艺条件的研究  35-39
      2.3.2.1 不同酶加量和酶解时间对酶水解率的影响  35-37
      2.3.2.2 温度对酶水解反应的影响  37-38
      2.3.2.3 底物浓度对酶水解率的影响  38-39
      2.3.2.4 pH 对酶水解反应的影响  39
  2.4 小结  39-41
第3章阳离子交换层析法分离核苷酸工艺条件的研究  41-57
  3.1 引言  41
  3.2 材料与方法  41-46
    3.2.1 实验试剂  41
    3.2.2 实验器材  41
    3.2.3 试验方法  41-46
      3.2.3.1 阳离子交换层析树脂的预处理  41-42
      3.2.3.2 阳离子交换树脂的初步分离 5‘-核苷酸的原理  42-43
      3.2.3.3 阳离子交换层析法分离核苷酸的操作步骤  43
      3.2.3.4 阳离子交换层析树脂的再生  43
      3.2.3.5 核酸水解液的制备  43-44
      3.2.3.6 5’-单核苷酸的定性检测（HPLC）  44-45
      3.2.3.7 5’-单核苷酸含量的测定-外标法  45
      3.2.3.8 核苷酸纯度、收率的计算方法  45-46
  3.3 结果和讨论  46-55
    3.3.1 四种5’-核苷酸标准品的HPLC 图  46
    3.3.2 核酸水解液的HPLC 图  46-47
    3.3.3 阳离子交换树脂的选型  47
    3.3.4 阳离子交换层析法分离核苷酸工艺条件的确定  47-51
      3.3.4.1 核酸水解液pH 对核苷酸初步分离的影响  47-48
      3.3.4.2 核苷酸溶液上样量对分离效果的影响  48-49
      3.3.4.3 洗脱液pH 对分离效果的影响  49-50
      3.3.4.4 洗脱液流速对核苷酸层析分离的影响  50-51
    3.3.5 层析色谱峰的分析、鉴定  51-53
    3.3.6 层析峰Ⅱ的二次分离  53-55
  3.4 小结  55-57
第4章 5’-UMP 阴离子交换层析树脂的分离纯化  57-63
  4.1 引言  57
  4.2 材料与方法  57-59
    4.2.1 实验试剂  57
    4.2.2 实验器材  57
    4.2.3 实验方法  57-59
      4.2.3.1 阴离子交换层析树脂的预处理  57
      4.2.3.2 阴离子交换层析法分离纯化5’-UMP 的原理  57-58
      4.2.3.3 阴离子交换层析法分离、纯化5’-UMP 的操作步骤  58
      4.2.3.4 阴离子交换层析树脂的再生  58
      4.2.3.5 5’-UMP 溶液的制备  58
      4.2.3.6 5’-UMP 纯度及收率的计算  58-59
  4.3 实验结果与讨论  59-62
    4.3.1 5’-UMP 浓缩液的 HPLC 色谱图  59
    4.3.2 阴离子交换树脂的选型  59
    4.3.3 阴离子交换层析法分离纯化 5‘-UMP 工艺条件的确定  59-61
      4.3.3.1 5‘-UMP 溶液最佳上样 pH 的确定  59-60
      4.3.3.2 洗脱液对 5‘-UMP 分离纯化效果的影响  60-61
    4.3.4 层析色谱峰的分析、鉴定  61-62
  4.4 小结  62-63
第5章结论与展望  63-65
  5.1 结论  63-64
  5.2 展望  64-65
参考文献  65-71
致谢  71-72
攻读硕士期间发表的论文  72

单核苷酸的制备及分离

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