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基于生物及化学反应发展生化分析新方法的研究

作　者: 李云
导　师: 李根喜
学　校: 南京大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亚硝酸盐 铂纳米颗粒 Griess反应 化学修饰电极 电化学 末端保护 切刻内切酶 相互作用 叶酸 叶酸受体
分类号: Q503
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


生化分析的发展对于解决人类健康问题和环境危机起着非常重要的作用。自然界中存在许多生物及化学反应,借助这些反应发展新的生化分析方法一直是学术界的热点课题。因此,我们可以利用一些有机反应并基于生物亲和性的特异性反应开展了生化分析新方法的研究,具体内容包括：1.基于Griess反应发展亚硝酸盐电化学检测新方法的研究亚硝酸盐可以与血红蛋白结合导致婴幼儿高铁血红蛋白症,并且与致癌的亚硝铵类形成有关。因此,设计一种能够灵敏、简便检测饮用水中亚硝酸盐浓度的方法对于人类健康和环境卫生来说越来越重要。在本章中,我们提出一种利用功能化铂纳米颗粒(PtNPs)来检测亚硝酸盐的新型电化学生物传感器。首先,在金电极表面修饰4-(2-氨乙基)苯胺,然后在铂纳米颗粒表面修饰5-[1, 2]dithiolan-3-yl-pentanoic acid [2-(naphthalene-1-ylamino)-ethyl]amide (DPAN)。当溶液中有亚硝酸盐离子存在时,金电极表面修饰的4-(2-氨乙基)苯胺就会与PtNPs表面的DPAN发生Griess反应。由此,PtNPs连接到金电极表面,并且通过利用PtNPs电催化H2O2还原反应产生的电化学信号可以达到检测亚硝酸盐离子的目的。本方法检测亚硝酸盐离子浓度的线性范围是10-1000μM,检测限达到5μM。在实验中,我们成功利用此方法来检测湖水中的亚硝酸盐离子,检测结果与标准化检测亚硝酸盐离子的紫外-可见光谱检测法一致。由此可以看出,此方法具有监测日常饮用水中的亚硝酸盐浓度的潜在应用价值。2.基于切刻内切酶辅助放大反应对蛋白质与小分子相互作用进行电化学分析的研究以适度亲和性和特异性结合某一特定蛋白质的小分子有机物不仅可以干扰蛋白质功能用于化学遗传学研究,而且可以定位蛋白质并用于蛋白质定量进行分子生物学诊断,因此,小分子与蛋白质间相互作用测试新方法的研究将有助于分子生物学诊断和治疗技术的发展。在本章中,我们结合末端保护和切刻内切酶辅助放大反应(NEA),以叶酸受体-叶酸间相互作用为例,提出了一种新的电化学方法来检测蛋白质-小分子间相互作用。首先,末端保护即当叶酸受体与ssDNA上的叶酸分子特异性结合后,叶酸-叶酸受体复合物可以保护ssDNA免受外切酶I (Exo I)的水解。其次,NEA反应即切刻内切酶可以识别双链DNA的特定核苷酸序列并只切割其中一条链。由于释放出另一条链可以与固定在电极表面具有特定序列的核苷酸杂交,从而启动第二轮的切割反应,在历经多个循环后,金电极表面核酸探针对溶液中电信号分子[Fe(CN)6]3-/4的阻碍作用逐渐降低,从而使电化学信号增加,达到灵敏检测蛋白质-小分子间相互作用的目的。相比于目前其他蛋白质-小分子间相互作用的检测法,此方法具有高灵敏度、高选择性、高产量、低成本和操作简便等优点,为今后检测蛋白质-小分子间相互作用提供了新的思路。

全文目录


中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
绪论  10-26
  1. 电化学简介  10-17
    1.1 电化学系统  10-12
    1.2 电化学方法  12-15
      1.2.1 电化学交流阻抗技术  13-14
      1.2.2 差分脉冲伏安法  14-15
    1.3 生物电化学  15
    1.4 生物传感器  15-16
    1.5 电化学生物传感器  16-17
  2. 纳米技术概述  17-23
    2.1 纳米材料概述及性质介绍  17-20
      2.1.1 表面效应  18-19
      2.1.2 小尺寸效应  19
      2.1.3 量子尺寸效应  19-20
      2.1.4 宏观量子隧道效应  20
    2.2 纳米材料在生命科学领域的应用  20-23
      2.2.1 在医学上的应用  20-21
      2.2.2 在生物工程上的应用  21
      2.2.3 在化工领域的应用  21
      2.2.4 在生化反应中的应用  21-22
      2.2.5 在药学方面的应用  22
      2.2.6 在生物传感器方面的应用  22-23
  3. 参考文献  23-26
第一章 基于Griess反应发展亚硝酸盐电化学检测新方法的研究  26-39
  1.1 引言  26-27
  1.2 实验部分  27-29
    1.2.1 实验试剂  27
    1.2.2 实验仪器  27
    1.2.3 DPAN功能化铂纳米颗粒的制备  27-28
    1.2.4 通过Griess反应将功能化PtNPs固定到电极表面  28
    1.2.5 电化学实验参数  28-29
    1.2.6 紫外-可见光谱法  29
  1.3 结果和讨论  29-36
  1.4 结论  36-37
  1.5 参考文献  37-39
第二章 基于切刻内切酶辅助放大反应对蛋白质与小分子相互作用进行电化学分析的研究  39-52
  2.1 引言  39-40
  2.2 实验部分  40-42
    2.2.1 实验试剂  40-41
    2.2.2 实验仪器  41
    2.2.3 将叶酸标记到NH_(2-)寡核苷酸  41
    2.2.4 探针1修饰金电极的制备  41-42
    2.2.5 电化学检测叶酸受体-叶酸相互作用  42
  2.3 实验结果与讨论  42-49
    2.3.1 电化学检测蛋白质-小分子相互作用体系组建  43-47
    2.3.2 电化学检测蛋白质-小分子间相互作用的定量关系  47-49
  2.4 结论  49-50
  2.5 参考文献  50-52
附录  52-53
致谢  53-54

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 一般性问题 > 生物化学技术
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