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新型电化学生物传感技术的研究及纳米材料在其中的应用

作　者: 聂华贵
导　师: 蒋健晖；俞汝勤
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 电化学生物传感器免疫传感器 DNA传感器酶传感器碳纳米管钌紫纳米线阵列 α-磷酸锆层状材料核酸末端保护分析
分类号: TP212.3
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

电化学生物传感技术由于所需仪器简单、选择性好、分析速度快、检测成本低、易于实现微型化等优点,在生物医学、环境监测、食品和医药等领域具有广泛的应用前景。如何利用电化学生物传感技术快速、灵敏检测疾病标志物以及环境中重金属离子,是当前医学和环境科学中既新颖又极具吸引力的热门研究课题之一。但是传统电化学生物传感器存在灵敏度较低,响应速度慢以及稳定性较差等缺点。近年来,纳米材料的出现为解决这些问题提供了新的思路。将纳米材料应用到电化学生物传感器中,由于其独特的性质可提高传感器的响应性能,已成为当前研究的焦点。此外,针对当前有机小分子和其结合蛋白相互作用检测中存在的问题,将这种特异性的相互作用转换成对小分子标记的DNA检测,由于DNA检测方法的多样性,因此这种分析方法有望用于临床药物筛选和靶蛋白质的灵敏检测。本论文针对这些问题,发展了一系列成本低、操作简单、灵敏度高的新型电化学生物传感技术,实现了对目标物的高灵敏检测。其主要内容如下:(1)碳纳米管(CNTs)由于具有比表面积大、导电性强、电催化活性高等优点,因而在电化学生物传感技术领域有着十分广泛的应用。为了进一步拓宽CNTs在电化学生物分析中的应用范围,在第2章发展了一种新型的、基于磷脂修饰MWNTs(PL/MWNTs)作为电化学标记物的电化学免疫传感技术。在该方法中,首先,通过非共价作用在MWNTs表面修饰磷脂分子,再利用磷脂分子末端的氨基共价交联单克隆抗体,这样便得到了PL/MWNTs电化学标记物。再通过传统的磁分离免疫夹心反应富集收集这种标记物,当沉积到十八烷基硫醇绝缘膜修饰的电极表面后,由于碳纳米管的隧道效应改变了绝缘膜的性质,产生了电化学响应信号。实验结果表明,这种新型的电化学免疫传感技术实现了对肿瘤标志物前列腺特异性抗原(PSA)的高灵敏、高特异性检测,响应动态范围为5 pg/mL到100 ng/mL,检测限为3 pg/mL,而且还能对人血清样品中PSA进行检测。该方法灵敏度高、选择性好、成本低,并可用于实际样品的检测。(2)鉴于上述发展的新型电化学免疫传感技术的高灵敏性和高特异性,为了拓宽这种技术在DNA分析中的应用范围,在第3章建立了一种基于单链DNA修饰MWNTs(ssDNA/MWNTs)作为电化学标记物磁分离检测DNA的电化学传感技术。在这种分析方法中,通过非共价作用可将ssDNA修饰到MWNTs表面,这不仅能使MWNTs稳定地分散水溶液中,同时又能使修饰在MWNTs表面DNA与目标DNA发生杂交反应。另外为了提高碱基错配识别的能力,在磁性纳米颗粒表面修饰了发夹探针。当目标DNA存在时,磁珠表面的发夹探针构象发生变化,茎部双链结构变为柔性单链结构,再通过传统的磁分离DNA夹心反应可以选择性收集ssDNA/MWNTs标记物,当吸附到十八烷基硫醇绝缘膜修饰的电极表面后,产生了二茂铁的氧化还原峰电流。该方法对目标DNA浓度检测的动态线性范围为1 pM ~500 nM,检测限可达0.9 pM。另外还可利用此方法对乙肝病毒特异性序列突变情况进行检测,使得突变型和野生型得到了很好的区分。(3)鉴于上述两个实验方案中,磁分离尽管可以富集收集电化学标记物MWNTs,但是磁性纳米颗粒也会增加背景电流,同时为了进一步简化上述实验操作步骤,因此在第4章中又发展了一种基于MWNTs作为电化学标记物通过链置换反应检测特定DNA序列的电化学生物传感技术。在这种分析方法中,由于双链互补DNA杂交反应的结合力远远高于DNA与MWNTs作用力,因此当有目标DNA存在时会,修饰在MWNTs表面的ssDNA会从MWNTs表面解离出来,MWNTs继而沉积到巯基十六酸修饰的电极表面,产生了电化学响应信号。而当没有目标DNA链存在时,由于修饰在MWNTs表面的DNA在中性溶液中会与修饰在电极表面的巯基十六酸产生静电排斥作用,致使MWNTs不能吸附在电极表面,降低了背景,因而实现了对目标DNA的灵敏、快速检测,其线性范围在10 pM ~ 100 nM之间,检测下限为5 pM。(4)在第5章中,将MWNTs电化学标记物链置换反应和Hg2+能特异性识别特定碱基对T-T结合起来,实现了污水中Hg2+的检测。实验考察了盐离子浓度、置换反应的温度以及干扰离子对此分析方法性能的影响。实验结果表明,此传感技术的电流响应与Hg2+浓度在20 nM ~ 10μM范围成良好的准线性关系,检测下限10 nM。(5)有序三维结构的纳米材料不仅为酶的固定提供了大量的活性位点和良好的微生物环境,同时它还能保证酶与底物之间尽可能有较大的接触面积,从而提高它在生物传感器应用中的响应性能。在第6章中,将聚碳酸酯膜固定到玻碳电极表面,通过恒电位沉积法制备了钌紫纳米线阵列。实验结果发现,钌紫纳米线阵列修饰的玻碳电极在低电位下对过氧化氢有良好的响应性能。另外当把葡萄糖氧化酶固定到钌紫纳米线阵列的表面后,葡萄糖氧化酶依然能保持良好的生物活性,因此通过此方法得到了性能良好的葡萄糖传感器。(6)层状材料由于具有层间距可调的性质,因此可往其层间插入各种各样不同尺寸大小的化合物。再加上这类无机化合物具有良好的生物相容性和化学稳定性、比表面积大、表面电荷密度高等优点,可适用于蛋白质的固定。在第7章中,提出了一种基于α-磷酸锆层状材料负载葡萄糖氧化酶的电化学生物传感器,并将其应用到葡萄糖的检测中。首先利用直接沉淀法制备了α-磷酸锆层状材料,在中性条件下将葡萄糖氧化酶插入到α-磷酸锆层状材料中,再通过壳聚糖分散并固定到电极表面。由于α-磷酸锆层状材料具有开放的结构,可使得葡萄糖氧化酶与底物充分地接触,从而提高了酶催化反应的效率。实验结果表明,该方法可实现了对葡萄糖的快速、灵敏定量检测,其线性范围为0.01 mM ~ 20 mM,检测下限为0.01 mM。(7)利用小分子标记的DNA来检测有机小分子与其结合蛋白质的相互作用是当前药物筛选和靶蛋白检测的一种新方法,其原理在于把这种特异性地相互作用转换成对DNA的分析,同时由于DNA放大检测方法的多样性,因此使得这种分析方法有望成为研究有机小分子和蛋白质相互作用的信号传导平台。核酸外切酶I末端保护分析就是这种分析方法中的一种,即当有机小分子与其结合蛋白质结合后抑制了ExoI对其降解,保存了小分子标记DNA的完整性。在第8章中,以生物素和链霉亲合素相互作用为模型,利用电活性标记物二茂铁对生物素标记的DNA链5’末端进行修饰,当DNA完整存在时,会使二茂铁极大程度地靠近电极表面,产生显著的氧化还原电流。根据所产生电流的大小可实现对链霉亲合素的定量检测。实验结果表明,链霉亲合素的浓度在10 pM ~ 1 nM范围内存在良好的准线性关系,同时该方法还具有较高的选择性和特异性的优点。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-16
第1章绪论  16-32
  1.1 电化学生物传感器的基本工作原理  16-17
  1.2 电化学生物传感器的分类  17-23
    1.2.1 电化学免疫传感器  17-19
    1.2.2 电化学DNA 传感器  19-21
    1.2.3 电化学酶传感器  21-23
  1.3 电化学生物传感器的应用现状及存在的问题  23-24
  1.4 基于纳米材料增强的电化学生物传感器  24-29
    1.4.1 碳纳米管  24-27
    1.4.2 纳米线阵列  27-28
    1.4.3 层状纳米材料  28-29
  1.5 核酸末端保护分析研究有机小分子配体与受体的相互作用  29-30
  1.6 本研究论文的工作内容  30-32
第2章磷脂修饰碳纳米管作为电化学标记物磁分离免疫分析  32-47
  2.1 前言  32-33
  2.2 实验部分  33-36
    2.2.1 试剂与仪器  33-34
    2.2.2 磷脂非共价修饰MWNTs  34
    2.2.3 MWNTs/ MAb_1 复合物的制备  34-35
    2.2.4 MB/MAb_2 复合物的制备  35-36
    2.2.5 电极表面的处理  36
    2.2.6 免疫分析及电化学检测  36
  2.3 结果与讨论  36-46
    2.3.1 磷脂修饰碳纳米管电化学标记物磁分离免疫分析的基本原理  36-37
    2.3.2 免疫传感技术分析的电化学响应  37-39
    2.3.3 信号转换机理  39-40
    2.3.4 TEM 对均相免疫复合物的表征  40
    2.3.5 SEM 对不同处理阶段电极表面形貌的表征  40
    2.3.6 交流阻抗谱法表征不同阶段电极表面情况  40-42
    2.3.7 经过不同处理后电极表面的电化学响应  42-43
    2.3.8 光学表征  43
    2.3.9 工作曲线  43-45
    2.3.10 免疫分析的干扰实验  45-46
    2.3.11 实际样品检测  46
  2.4 小结  46-47
第3章基于DNA 修饰碳纳米管作为电化学标记物磁分离DNA 分析  47-58
  3.1 前言  47-49
  3.2 实验部分  49-50
    3.2.1 试剂与仪器  49
    3.2.2 单链DNA Probe 2 修饰MWNTs  49-50
    3.2.3 MBs/Probe 1 复合物的制备  50
    3.2.4 电极表面的处理  50
    3.2.5 DNA 杂交反应及电化学检测  50
  3.3 结果与讨论  50-57
    3.3.1 核酸链的设计和杂交温度  50-51
    3.3.2 DNA 杂交分析的电化学响应  51-52
    3.3.3 实验条件优化  52
    3.3.4 光学表征  52-54
    3.3.5 经过不同处理后电极表面的交流阻抗表征  54-55
    3.3.6 经过不同处理后电极表面的SEM 表征  55
    3.3.7 工作曲线  55-57
    3.3.8 特异性碱基错配检测  57
  3.4 小结  57-58
第4章基于碳纳米管电化学标记链置换测定DNA  58-65
  4.1 前言  58-59
  4.2 实验部分  59-60
    4.2.1 试剂与仪器  59
    4.2.2 单链DNA P1 修饰MWNTs  59
    4.2.3 电极表面的处理  59-60
    4.2.4 链置换DNA 杂交反应及电化学检测  60
  4.3 结果与讨论  60-64
    4.3.1 DNA 杂交检测的电化学响应  60-61
    4.3.2 DNA 杂交检测的交流阻抗表征  61
    4.3.3 实验条件的优化  61-63
    4.3.4 对目标DNA 链的测定  63-64
  4.4 小结  64-65
第5章基于碳纳米管电化学标记链置换测定汞离子  65-71
  5.1 前言  65-66
  5.2 实验部分  66-67
    5.2.1 试剂与仪器  66
    5.2.2 DNA P1 修饰碳纳米管MWNTs  66
    5.2.3 电极表面的处理  66
    5.2.4 DNA 杂交反应及电化学检测  66-67
  5.3 结果与讨论  67-70
    5.3.1 Hg~(2+)测定的电化学响应  67-68
    5.3.2 反应体系中Na+离子浓度的优化  68
    5.3.3 链置换反应温度的优化  68
    5.3.4 对Hg~(2+)的测定  68
    5.3.5 干扰离子测定  68-70
  5.4 小结  70-71
第6章钌紫纳米线阵列的制备及在电化学葡萄糖传感器中的应用  71-81
  6.1 前言  71-72
  6.2 实验部分  72-73
    6.2.1 试剂与仪器  72
    6.2.2 RPNWA 电极的制备  72-73
    6.2.3 GOx 修饰的RPNWA 电极的制备  73
  6.3 结果与讨论  73-80
    6.3.1 RPNWA 的表征  73-75
    6.3.2 RPNWA 修饰电极的电化学性质  75-78
    6.3.3 过氧化氢的检测  78
    6.3.4 葡萄糖的检测  78-80
  6.4 小结  80-81
第7章 Α-磷酸锆的合成及在电化学葡萄糖传感器中的应用  81-91
  7.1 前言  81-82
  7.2 实验部分  82-84
    7.2.1 试剂与仪器  82
    7.2.2 α-ZrP 的合成  82-83
    7.2.3 α-ZrP 的剥离和葡萄糖氧化酶的固定  83
    7.2.4 葡萄糖生物传感器的制备  83-84
  7.3 结果及讨论  84-90
    7.3.1 α-ZrP 和GOx/α-ZrP 的表征  84-85
    7.3.2 GOx/α-ZrP 修饰电极的电化学性质  85-89
    7.3.3 生物传感器的响应特性及葡萄糖的检测  89-90
  7.4 小结  90-91
第8章基于核酸外切酶I 末端保护分析小分子与蛋白质相互作用的电化学生物传感器  91-102
  8.1 前言  91-92
  8.2 实验部分  92-94
    8.2.1 试剂与仪器  92-93
    8.2.2 硫辛酸和二茂铁甲酸标记氨基修饰的核酸链  93
    8.2.3 核酸末端保护分析反应  93
    8.2.4 捕获探针在金电极上的组装  93-94
    8.2.5 固相表面杂交及电化学检测  94
  8.3 结果与讨论  94-101
    8.3.1 毛细管电泳和凝胶电泳分析  94-96
    8.3.2 传感器的电化学响应  96-97
    8.3.3 传感器在不同扫描速度下的电化学行为  97
    8.3.4 传感器在Fe(CN)63-/4-溶液中的交流阻抗特性  97-99
    8.3.5 反应条件的优化  99
    8.3.6 保护分析的特异性  99-101
    8.3.7 工作曲线  101
  8.4 小结  101-102
结论  102-104
参考文献  104-129
附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录  129-130
致谢  130

新型电化学生物传感技术的研究及纳米材料在其中的应用

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