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淫羊藿苷抗骨质疏松分子机理研究

作　者: 翟远坤
导　师: 陈克明
学　校: 兰州理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 淫羊藿苷淫羊藿次苷II 骨髓间充质干细胞成骨性分化雌激素信号通路 NO-cGMP-PKG信号通路信号转导
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

原发性骨质疏松是一种以骨量减少、骨显微结构退化为特征,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的全身性骨骼疾病。目前,骨质疏松症的治疗主要采用激素替代疗法、降钙素、双磷酸盐、氟化物等,虽然有一定疗效但副作用明显。中草药治疗骨质疏松的历史悠久,具有见效快、无毒副作用和费用低廉等优点。淫羊藿(Herba Epimedii)系小檗科(Berberidacae)淫羊藿属(Epimedium)植物,具有补肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿之功效,是中医治疗骨质疏松方剂中应用频率最高的一味草药。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最为丰富的黄酮苷类化合物,其抗骨质疏松活性已有较多报道,但其活性形式和确切的作用机理目前尚不清楚。我们为此设计并开展了一系列实验研究,主要包括:1.对比淫羊藿苷和其主要代谢产物—淫羊藿次苷II对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响,比较二者药理活性的高低,确定正确的给药途径。2.采用骨髓间充质干细胞做为干预对象,研究淫羊藿次苷II在促进其成骨性分化过程中对雌激素信号通路的影响,探讨雌激素信号通路与骨髓间充质干细胞成骨性分化过程的联系。3.建立大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养,研究淫羊藿次苷II在促进其成骨性分化过程中对NO-cGMP-PKG信号通路的影响,探讨淫羊藿次苷II、NO-cGMP-PKG信号通路、骨髓间充质干细胞成骨性分化过程此三者之间的关系。所得结论如下:1.淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ均可促进骨髓间充质干细胞得成骨性分化,但淫羊藿次苷II的活性明显高于淫羊藿苷,具体表现在明显提高ALP活性,增加CFU-FALP、骨钙素分泌量、钙盐沉积量及钙化结节数量,并可强烈促进成骨性分化因子bFGF、IGF-1和转录因子Osterix(OSX)和Runx-2的基因表达。2. ICS II可显著增强碱性磷酸酶(ALP)活性,促进骨钙素、I型胶原蛋白的分泌和钙盐沉积,与成骨性分化相关的因子OSX和Runx-2的基因表达量也显著升高,但这些效应均可被雌激素通路的特异性阻断剂ICI 182.780所抑制。3. ICS II可显著促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨性分化,但促进效应均可被NO-cGMP-PKG通路的特异性阻断剂(L-NAME、ODQ、PDE5)所抑制,表明ICS II是通过激活NO-cGMP-PKG通路来促进成骨性分化的。上述实验结果表明,淫羊藿苷经口服后,体内的主要代谢产物—淫羊藿次苷II具有较强的促骨形成活性,证明了口服给药的合理性。对作用机理的研究发现,淫羊藿次苷II在促进成骨性分化的过程中同时激活了雌激素信号通路和NO-cGMP-PKG信号通路,表明其药理作用是多靶点的。

全文目录

摘要  9-10
Abstract  10-12
英文缩写词表  12-14
第1章绪论  14-20
  1.1 国内外研究现状综述  15-17
    1.1.1 淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞的影响  15-16
    1.1.2 淫羊藿苷及其代谢物雌激素样作用的研究  16
    1.1.3 淫羊藿苷与 NO 信号途径的研究  16-17
  1.2 淫羊藿苷防治骨质疏松存在的问题  17-18
  1.3 展望  18
  1.4 本文构想  18-20
第2章骨髓间充质干细胞的体外分离、培养与诱导分化  20-26
  2.1 材料和方法  20-22
    2.1.1 主要试剂  20
    2.1.2 主要仪器  20-21
    2.1.3 试剂配制  21
    2.1.4 骨髓间充质干细胞的分离与培养  21-22
    2.1.5 骨髓间充质干细胞的诱导分化  22
  2.2 结果  22-23
    2.2.1 形态学观察  22-23
    2.2.2 碱性磷酸酶染色  23
    2.2.3 矿化结节染色  23
  2.3 讨论  23-26
第3章淫羊藿苷与其主要代谢产物淫羊藿次苷Ⅱ对骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响  26-36
  3.1 材料与方法  26-30
    3.1.1 实验材料  26
    3.1.2 主要仪器  26
    3.1.3 主要试剂  26-27
    3.1.4 试剂配制  27
    3.1.5 骨髓间充质干细胞的分离与培养  27
    3.1.6 药物干预  27-28
    3.1.7 成骨性分化指标检测  28-30
      3.1.7.1 ALP 活性检测  28
      3.1.7.2 碱磷酶阳性克隆（CFU-FALP）分析  28
      3.1.7.3 骨钙素含量的测定  28
      3.1.7.4 钙盐沉积量的测定  28
      3.1.7.5 钙化结节分析  28
      3.1.7.6 RT-Real Time PCR 分析  28-30
    3.1.8 统计学分析  30
  3.2 结果  30-34
    3.2.1 ICA 和 ICS II 对 ALP 活性的影响  30-31
    3.2.2 ALP 组织化学染色结果  31
    3.2.3 对骨钙素分泌量的影响  31-32
    3.2.4 对钙化结节的影响  32
    3.2.5 对钙盐沉积量的影响  32-33
    3.2.6 Real Time RT-PCR 实验结果  33-34
      3.2.6.1 总 RNA 质量鉴定  33
      3.2.6.2 各基因相对表达量检测  33-34
  3.3 讨论  34-36
第4章淫羊藿次苷Ⅱ对rBMSCs 成骨性分化过程中雌激素通路的影响  36-46
  4.1 材料  36-37
    4.1.1 实验动物  36
    4.1.2 主要试剂与仪器  36-37
  4.2 方法  37-39
    4.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养  37
    4.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的前处理及药物干预  37
    4.2.3 ALP 活性测定  37
    4.2.4 骨钙素分泌量的测定  37
    4.2.5 钙盐沉积量的测定  37
    4.2.6 Real Time RT-PCR 分析  37-38
    4.2.7 Western-blot  38
    4.2.8 统计学分析  38-39
  4.3 结果  39-45
    4.3.1 ALP 活性分析  39
    4.3.2 骨钙素分泌量分析  39-40
    4.3.3 钙盐沉积量分析  40-41
    4.3.4 Real Time RT-PCR 分析  41-42
      4.3.4.1 成骨相关基因表达情况  41
      4.3.4.2 雌激素通路相关基因表达情况  41-42
    4.3.5 Western-blot 分析  42-45
      4.3.5.1 I 型胶原蛋白表达量分析  42-43
      4.3.5.2 ERα蛋白表达量分析  43
      4.3.5.3 PR 蛋白表达量分析  43-44
      4.3.5.4 PS-2 蛋白表达量分析  44-45
  4.4 讨论  45-46
第5章淫羊藿次苷Ⅱ对 rBMSCs 成骨性分化过程中 NO-cGMP-PKG 信号通路的影响  46-55
  5.1 材料  46-47
    5.1.1 实验动物  46
    5.1.2 主要仪器与试剂  46-47
  5.2 方法  47-49
    5.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养  47
    5.2.2 实验分组及药物干预  47
    5.2.3 ALP 活性分析  47
    5.2.4 骨钙素分泌量测定  47
    5.2.5 钙盐沉积量测定  47-48
    5.2.6 iNOS活性测定  48
    5.2.7 NO 生成量测定  48
    5.2.8 cGMP 生成量测定  48
    5.2.9 Real Time RT-PCR 测定  48
    5.2.10 Western-blot 分析  48-49
    5.2.11 统计学分析  49
  5.3 结果  49-53
    5.3.1 ALP 活性测定结果  49
    5.3.2 ICS II 及相关阻断剂对骨钙素的影响  49-50
    5.3.3 ICS II 及通路阻断剂对钙盐沉积量的影响  50
    5.3.4 ICS II和L-NAME对iNOS及NO表达的影响  50-51
    5.3.5 ICS II和ODQ对sGC及cGMP表达的影响  51-52
    5.3.6 ICS II和PDE5对cGMP及PKG表达的影响  52-53
  5.4 讨论  53-55
结论  55-56
  不足与展望  55-56
参考文献  56-63
致谢  63-64
附录A：攻读学位期间所发表的学术论文目录  64

淫羊藿苷抗骨质疏松分子机理研究

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