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NDV7793刺激小鼠单核—巨噬细胞对肝癌细胞的杀伤作用

作　者: 宫金伶
导　师: 樊晓晖
学　校: 广西医科大学
专　业: 微生物学
关键词: NDV 小鼠单核-巨噬细胞肝癌细胞
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 13次
引　用: 1次
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内容摘要

背景和目的:新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)为副黏病毒科Avulavirus属的一员[1],它不但能感染禽类致病,而且能杀伤肿瘤细胞,但对人正常细胞无明显毒副作用[2]。其抗肿瘤能力及机制一直受到广泛的关注[3-6]。从上世纪60年代开始便有报道称用NDV治疗癌症。随后,人们陆陆续续展开其抗肿瘤功能的进一步研究。用NDV治疗肿瘤,作为继手术、化疗及放疗之后的一种新的生物治疗癌症的手段,已经越来越多引起人们的关注。本研究将NDV 7793于体内外刺激BALB/C小鼠单核-巨噬细胞,然后将刺激后的小鼠单核-巨噬细胞与小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞混合培养,用LDH微量释放法测定小鼠单核-巨噬细胞对小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞的杀伤效应。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来分别测定体内外刺激小鼠后产生的TNF-α以及TRAIL的水平,采用半定量PCR检测NDV刺激前后小鼠单核-巨噬细胞TRAIL mRNA表达水平。同时我们设立IFN-β阳性对照组、UV-NDV对照组以及空白对照组,对比经NDV刺激和未受NDV刺激的小鼠单核-巨噬细胞杀伤小鼠肝癌细胞效应的改变,进而探讨NDV7793弱毒株刺激机体非特异性免疫系统,发挥抗肿瘤效应的机制。材料与方法本实验所用新城疫病毒WDK/JX/7793/2004(简称NDV 7793)分离自江西鄱阳湖的野鸭。采用鸡胚扩增的方法进行病毒扩增,收集48h后的鸡胚尿囊液,测其血凝效价≥1:1024,用高速离心的方法进行病毒纯化。常规细胞培养方法培养Vero-E6和Novikoff细胞株。在体外实验中,采用腹腔灌液的方法收集小鼠的腹腔液,然后用贴壁的方法筛选巨噬细胞,用20HU/ml的NDV 7793刺激小鼠单核-巨噬细胞,收集NDV刺激后的细胞培养上清,测定其TNF-α及TRAIL的浓度。同时用半定量的RT-PCR来测定小鼠刺激前后的TRAIL的mRNA水平。将刺激12h的小鼠单核-巨噬细胞与小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞共培养12h,通过测定细胞培养上清中LDH含量来分析NDV 7793刺激前后其对Novikoff细胞的杀伤效应。在体内实验中,给小鼠腹腔注射NDV7793,每天一次,每次注射200HU,共5天,第6天将其处死,抽取其腹腔液,检测项目与体外实验项目相同。结果:在体外实验中,NDV7793刺激小鼠单核-巨噬细胞4h,8h,12h,16h及24h后,NDV实验组细胞培养上清中TNF-α的浓度于12h达到最高,且高于其它各组,差异有统计学意义(p<0.01)。此外,NDV7793刺激小鼠的单核-巨噬细胞12h后,细胞培养上清中TRAIL的浓度也较未刺激前增高,差异有统计学意义(p<0.01)。RT-PCR结果显示,小鼠单核-巨噬细胞受NDV7793刺激后TRAIL mRNA的表达量增高, 4h时TRAIL mRNA的表达量到达峰值,16h开始下降。最后,NDV7793刺激小鼠单核-巨噬细胞12h后,将受NDV7793刺激的单核-巨噬细胞与小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞分别按照5:1、10:1、20:1、30:1共培养12h,测定细胞培养上清中LDH,得到NDV7793实验组小鼠单核-巨噬细胞对小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞的杀伤率较空白对照组增高,差异有统计学意义(p<0.01),且效靶比为20:1时杀伤率最强。在体内实验中,NDV7793注射小鼠5d后,血清中TNF-α及TRAIL浓度较未注射对照组增多,差异有统计学意义(p<0.01)。同时小鼠单核-巨噬细胞在被NDV7793刺激后,细胞中的TRAIL mRNA表达也明显增多。NDV7793注射后,小鼠Mφ对小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞的杀伤作用较UV-NDV及PBS对照组明显增强,差异有统计学意义(p<0.05)。NDV7793组的小鼠Mφ对Novikoff细胞的杀伤作用随着效靶比的变化而变化,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1、NDV7793于体内外都能够激活小鼠的单核-巨噬细胞,且激活后的小鼠的单核-巨噬细胞对小鼠肝癌细胞株Novikoff细胞的杀伤作用增强。2、活化后的小鼠单核-巨噬细胞杀伤Novikoff细胞的能力增强可能与TRAIL有关。

全文目录

主要英文缩写  4-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-15
第一部分 NDV7793 体外条件下刺激小鼠MΦ对肝癌细胞的杀伤作用材料和方法  15-39
  材料与方法  15-27
  结果  27-33
  讨论  33-36
  参考文献  36-39
第二部分 NDV7793 体内注射小鼠后Mφ对Novikoff 杀伤作用的变化材料和方法  39-53
  材料与方法  39-45
  结果  45-48
  讨论  48-51
  参考文献  51-53
结论  53-54
综述  54-78
  综述参考文献  70-78
致谢  78

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