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控制花生籽粒油酸含量相关基因的鉴定与分析

作　者: 周丽侠
导　师: 毕玉平；单雷
学　校: 山东师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 花生 油酸 硬脂酰ACP脱氢酶 △12脂肪酸脱氢酶 基因工程 DNA分子标记
分类号: S565.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


花生是重要的油料作物,它富含优质蛋白和脂肪,是人们健身增寿的食疗保健佳品。花生籽粒油脂的品质是由脂肪酸的组成决定的,高油酸的花生稳定性好、营养价值高,越来越受到人们的喜爱。因而,提高油酸的相对含量,增加油酸/亚油酸（O/L）的比值,已成为目前油料作物育种的重要内容,与此同时与油酸积累相关的两个关键酶——硬脂酰ACP脱氢酶（stearoyl–acyl carrier protein （ACP） desaturase,SAD）和微粒体△12脂肪酸脱氢酶(delta 12 fatty acid desaturase,Δ12FAD或FAD2)引起了众多研究者的关注。SAD催化硬脂酰基的第9-10碳原子间脱氢形成第一个双键,产生油酰基载体蛋白。它是油酸积累的关键酶,在决定植物饱和和不饱和脂肪酸的比例上起重要作用,它对植物的生理功能也有重要影响。本实验利用同源克隆方法,从花生鲁花14中克隆得到了两个AhSAD基因,分别将它们命名为AhSAD1-1和AhSAD1-2。对AhSAD1基因的cDNA序列进行较系统的生物信息学分析,包括多序列比对、同源性分析、蛋白质理化特性以及结构预测与特征分析,结果表明AhSAD1和其它植物的SAD氨基酸序列间有很高的同源性,在所比较的SAD中,AhSAD1和它们的同源性都在73%以上。具功能的AhSAD1分子是一个同型二聚体,它在进化上较为保守,含一个属于酰基ACP脱氢酶（Acyl-Acyl Carrier Protein Desaturase, AAD）家族和类铁蛋白（Ferritin-1ike）家族的保守结构域。基因表达模式分析显示,AhSAD1在发育的种子中的表达量最高,且在果针入土50天后达到最高峰,结合花生种子发育过程中硬脂酸和油酸积累发展趋势,说明该基因在调控脂肪酸积累和组成上具有重要作用。同时,为了进一步研究鲁花14中两种AhSAD1蛋白的具体功能,我们构建了CaMV35S启动子驱动的过量表达AhSAD1基因的植物过量表达载体pCAMBIA3301-35S-AhSAD1-1和pCAMBIA3301-35S-AhSAD1-2。利用农杆菌介导法分别将它们导入拟南芥、烟草、花生,经检测证明,该基因已经成功整合入烟草、花生基因组中,为进一步选育性状优良的高油酸花生品种奠定了基础。FAD2催化油酸在碳12位上脱氢生成亚油酸,是控制籽粒油酸、亚油酸含量和O/L比值的关键酶。为了深入了解控制花生O/L比值的遗传基础,提高花生品质育种效率,本实验室对鲁花14等13个花生栽培品种Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2基因的编码区进行了序列分析。结果表明:该基因在13个花生品种中皆存在3类转录本:即AhFAD2A、AhFAD2B和AhFAD2C。临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花14、花育19、花育23这些品种在AhFAD2A基因448位点存在G→A点突变,该突变导致编码酶活几尽丧失,鲁花11在此位点为G/A杂合,除此之外AhFAD2A基因在某些品种的其他8个位点也存在多态性。AhFAD2B基因相对保守,所测13个花生品种的核苷酸序列基本相同;AhFAD2C基因的G451T点突变,形成TAA终止子;或674680 bp之间7 bp的片段插入,导致移码,形成TGA终止子,使得AhFAD2C不能编码完整蛋白,为假基因。OL1编码具有活性的AhFAD2A脱氢酶,OL2编码AhFAD2B脱氢酶。ol1是AhFAD2A的一个突变等位基因;ol2是AhFAD2B的隐性等位基因。故我们认为,台山珍珠、台山三粒肉、江田种、Chico、05-21063、白沙1016的基因型是OL1OL1OL2OL2;临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花14、花育19、花育23的基因型是ol1ol1OL2OL2;鲁花11的基因型可能存在OL1ol1杂合等位位点。结合对这些品种籽粒中脂肪酸的组分气相色谱分析发现,籽粒O/L比值大于1.5的品种临桂麻壳、勾了种、鲁花11、鲁花14、花育19、花育23 AhFAD2A基因在448位点也存在G→A点突变,这表明AhFAD2A基因G448A点突变是造成花生品种籽粒的O/L比值相对提高的因素之一。本研究同时对假基因可能存在的功能进行了讨论。

全文目录


中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
符号说明  10-11
第一部分 文献综述  11-27
  1 油酸的价值  12
  2 植物脂肪酸合成途径与油酸的生物合成  12-15
    2.1 植物脂肪酸的一般合成途径  12-13
    2.2 油脂的合成  13-14
    2.3 油脂中油酸的合成与积累  14-15
  3 与油酸积累相关的两个关键脱氢酶  15-21
    3.1 硬脂酰ACP 脱氢酶（SAD）  15-18
      3.1.1 SAD 基因及其编码的氨基酸  15-16
      3.1.2 SAD 的结构与特征  16
      3.1.3 SAD 的表达与功能  16-18
    3.2 微粒体△~(12) 脂肪酸脱氢酶（delta 12 fatty acid desaturase, Δ~(12)FAD 或FAD2  18-21
      3.2.1 FAD2 基因  18-19
      3.2.2 FAD2 的性质和结构  19-20
      3.2.3 FAD2 促成高油酸性状的分子基础  20-21
  4 高油酸油料作物的遗传改良  21-27
    4.1 基因工程遗传改良  21-22
    4.2 分子标记辅助选育  22-27
      4.2.1 几种常用的DNA 分子标记原理及特点  22-24
      4.2.2 分子标记在高油酸油料作物遗传育种中的应用  24-27
第二部分 实验论文  27-69
  第一章 花生硬脂酰ACP 脱氢酶（SAD）基因的克隆和分析  27-57
    一、材料和方法  27-42
      1 实验材料  27-33
        1.1 植物材料  27-28
        1.2 菌株和质粒  28
        1.3 试剂和培养基  28-32
        1.4 主要仪器设备  32
        1.5 引物序列  32-33
      2 实验方法  33-42
        2.1 基本分子生物学实验  33-37
        2.2 AhSAD 基因的克隆  37
        2.3 花生AhSAD1 基因的生物信息学分析  37-38
        2.4 基于半定量RT-PCR 的AhSAD1 的表达分析  38-39
        2.5 AhSAD1 基因过量表达载体的构建  39-40
        2.6 农杆菌介导的转化  40-42
    二、结果与分析  42-54
      1 花生AhSAD 基因的克隆及分析  42-49
        1.1 花生AhSAD 基因的克隆和序列分析  42-45
        1.2 AhSAD1-1 和AhSAD1-2 编码多肽的特性分析  45
        1.3 AhSAD1-1 和AhSAD1-2 编码蛋白的同源性分析  45-48
        1.4 AhSAD1 基因的表达分析  48-49
      2 过量表达AhSAD1 植物表达载体的构建与验证  49-51
        2.1 植物表达载体的构建  49-50
        2.2 植物表达载体的酶切验证  50-51
      3 烟草、花生的遗传转化  51-54
        3.1 烟草遗传转化及转基因植株检测  51-52
        3.2 花生遗传转化及转基因植株检测  52-54
    三讨论  54-57
  第二章 花生AHFAD2 基因的多态性及其与籽粒油酸  57-69
    一、材料与方法  58-60
      1 实验材料  58
        1.1 植物材料  58
        1.2 菌株及质粒  58
        1.3 试剂、培养基和主要仪器设备  58
        1.4 引物序列  58
      2 实验方法  58-60
        2.1 RNA 提取和cDNA 合成  58
        2.2 目的基因扩增  58-59
        2.3 PCR 产物的回收、克隆与测序  59
        2.4 序列分析  59
        2.5 花生种子脂肪酸组分的分析  59-60
    二、结果与分析  60-65
      1 AhFAD2 基因编码区有效序列的确定  60
      2 AhFAD2 基因转录本的分类及差异分析  60-63
      3 AhFAD2A 和AhFAD2B在不同品种中的多态性  63-64
      4 花生脂肪酸组分的测定结果  64-65
    三、讨论  65-68
      1 O/L 比值性状的遗传基础  65-66
      2 AhFAD2 基因的多态性与O/L 比值之间的相关性  66-67
      3 假基因功能的相关探讨  67-68
    四 结论  68-69
参考文献  69-77
致谢  77-78
硕士期间发表的论文  78

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 花生
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