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鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析

作　者: 刘巍
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性支气管炎病毒鸡胚交叉中和试验 S1基因序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 85次
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内容摘要

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis, IB)是由冠状病毒科(Coronaviridae)传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。该病主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统,可以引起雏鸡死亡,蛋鸡产蛋量及蛋品质下降,给养禽业造成巨大的经济损失。IBV突出的特点是血清型众多,且新的血清型和变异株不断出现,给本病的防治带来很大困难,免疫失败现象时有发生,所以从现地分离株中筛选疫苗株对控制IB非常重要。IBV的基因组为不分节段的单股正链RNA,编码三种主要结构蛋白(纤突蛋白S,膜蛋白M和核衣壳蛋白N)及其它蛋白。IBV的S蛋白可以裂解成S1和S2两个亚单位。S1是重要的免疫原蛋白,能诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体,并且与病毒的组织嗜性有关。S1基因的点突变、插入、缺失或者重组是IBV产生新血清型,亚型和变异株的主要原因,对于S1基因的变异与病毒的抗原性的改变之间是否存在一致性尚不清楚。故对S1基因深入研究具有重要意义。从分子水平研究S1基因的分子结构和遗传进化特点,可以为IB的防控提供可靠的理论依据。2008年1月,河北沧州某产蛋鸡场鸡群出现以呼吸道症状为主的疾病症候,并迅速波及全群,少数几只出现死亡,死亡率约0.5%。剖检发现鸡只肾脏肿大,有尿酸盐沉积,呈“花斑肾”样,其它脏器器官未见明显病变。已知该鸡群曾按正常程序进行接种过IBV H120疫苗。本试验收集患病鸡只肾脏、气管等组织,进行病毒分离培养。通过新城疫病毒干扰试验、致鸡胚矮小化试验、血凝特性试验、动物回归试验以及分子生物学试验等证实分离到的0801株为一株传染性支气管炎病毒。交叉中和实验结果显示,0801株与Ma5、W93、H120、M41、H52株的关系系数R分别为80.7%、67.7%、73.3%、54.0%、70.8%。依据判定标准(R>80%,两毒株为同一亚型;25%<R<80%,两毒株为同一血清型的不同亚型;R<25%,两毒株为不同的血清型),判定0801株与疫苗株Ma5、W93、H120、M41、H52株均为同一血清型,其中与疫苗株Ma5株为同一血清型的同一亚型。本研究中对0801株S1基因进行了序列测定,并与国内外已发表参考株S1基因进行了比较分析,结果表明,0801株与当前普遍应用的Massachusetts型疫苗株H120、H52、Ma5、M41及国内疫苗株W93株核苷酸同源性约为75%,推导氨基酸序列对比结果显示同源性亦约为75%,同时与Genbank注册的Arkansas、Conn、Gray、793/B等血清型同源性差异亦在20%以上。而Genbank BLAST对比结果显示0801株S1基因与国内分离株LC2、WF株S1基因同源性最高,其核苷酸同源性高达99%,氨基酸同源性亦接近99%。序列分析结果显示0801株S蛋白裂解位点序列为RRFRR,符合传支毒株裂解位点序列。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 引言  12-30
  1.1 鸡传染性支气管炎概述  12-15
    1.1.1 IBV 的分类  12-13
    1.1.2 IBV 的粒子结构  13
    1.1.3 IBV 的基因组  13-14
    1.1.4 IBV 的理化特性  14-15
    1.1.5 IBV 的生物学特性  15
  1.2 IBV 的分子生物学研究进展  15-23
    1.2.1 IBV 的主要结构蛋白及功能  15-20
    1.2.2 IBV 的复制机制  20-22
    1.2.3 IBV 的变异机制  22-23
  1.3 IBV 的分型研究进展  23-28
    1.3.1 国外对IBV 的分型研究  23
    1.3.2 国内对IBV 的分型研究  23-24
    1.3.3 IBV 血清型鉴定方法  24-28
  1.4 IBV 的检测与防控  28-30
    1.4.1 检测方法  28-29
    1.4.2 防控技术  29-30
2 材料与方法  30-37
  2.1 材料  30-32
    2.1.1 病料及毒株背景资料  30
    2.1.2 供试毒株与鸡胚  30
    2.1.3 主要材料及试剂  30
    2.1.4 引物  30
    2.1.5 参考毒株及其 GeneBank 登录号  30-32
  2.2 方法  32-37
    2.2.1 病毒的分离鉴定  32-33
    2.2.2 鸡胚交叉中和试验  33
    2.2.3 S1 基因的克隆与序列分析  33-37
3 结果与分析  37-44
  3.1 病毒的分离鉴定  37-40
    3.1.1 病毒的鸡胚传代结果  37-38
    3.1.2 新城疫病毒干扰试验  38
    3.1.3 致鸡胚矮小化试验  38
    3.1.4 血凝试验  38-39
    3.1.5 鸡胚半数感染量（EID50）测定  39
    3.1.6 动物回归试验  39-40
  3.2 鸡胚交叉中和试验  40-42
    3.2.1 试验毒株的鸡胚半数感染量（EID50）测定  40
    3.2.2 鸡胚交叉中和试验结果  40-42
  3.3 S1 基因的克隆及序列分析  42-44
    3.3.1 RT-PCR 扩增结果  42
    3.3.2 重组质粒的鉴定  42
    3.3.3 S1 基因的克隆和序列测定  42
    3.3.4 S1 基因系统发育分析  42-43
    3.3.5 S1 基因同源性分析  43-44
    3.3.6 氨基酸序列分析  44
4 讨论  44-47
5 结论  47-48
参考文献  48-58
致谢  58-59
攻读学位期间发表论文情况  59-60
硕士学位论文内容简介及自评  60

鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析

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