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毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF

作　者: 张大成
导　师: 金坚
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: N-糖基化毕赤酵母X-33 基因敲除粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种单细胞真核生物,具有原核表达系统生长速度快、蛋白表达量高、培养成本低的特点,又能像真核细胞那样对蛋白进行翻译后加工修饰如糖基化,因此广泛用于蛋白的表达。与哺乳动物细胞对蛋白N-糖基化修饰形成复杂型糖链不同,毕赤酵母对蛋白N-糖基化修饰的特点是产生高甘露糖型糖链且易发生过度糖基化修饰,导致糖蛋白的活性降低、免疫原性增强、半衰期缩短等一系列不良影响,从而限制了毕赤酵母表达糖蛋白尤其是糖蛋白类药物的应用。为了降低毕赤酵母对糖蛋白的过度糖基化修饰,构建一个对糖蛋白低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,同时为进一步的N-糖基化改造提供一个基础。本研究采用双交换同源重组敲除目的基因的方法,敲除毕赤酵母X-33过度N-糖基化修饰过程中一个关键的基因OCH1,构建X-33(och1-)菌株,并对其表达糖蛋白GM-CSF进行了研究。本研究以野生型毕赤酵母X-33作为改造菌株,从P. pastoris X-33菌株基因组中克隆URA3基因及其两端同源臂片段,再用重叠PCR的方法融合两同源臂序列。然后将融合同源臂片段电击转入X-33细胞,通过双交换同源重组首先敲除其URA3基因,获得一个尿嘧啶营养缺陷型菌株X-33(ura3-),而且在敲除URA3基因的同时没有引入外源选择标记。表型鉴定表明X-33(ura3-)菌株性状稳定,回复突变率低,基因组鉴定表明其URA3基因读码框缺失约500 bp的序列。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达载体pYES2为模板,扩增其含URA3基因序列的部分,构建载体pYES。从X-33菌株基因组中扩增OCH1基因及两端同源臂片段,再用重叠PCR的方法融合两同源臂序列。将OCH1基因两端同源臂融合片段克隆到pYES载体,构建敲除质粒pYES-OCH1。将pYES-OCH1质粒于两同源臂间以Mlu1酶切线性化,电击转入X-33(ura3-)细胞。以URA3作为选择标记,敲除其OCH1基因,获得X-33(och1-)菌株。表型鉴定表明X-33(och1-)菌株在37℃下温度敏感,基因组鉴定表明其OCH1基因读码框缺失约1300 bp的序列。SDS-PAGE和Western blot检测表明,与野生型X-33表达的分子量为35 kDa左右的糖蛋白GM-CSF相比,用X-33(och1-)菌株表达的GM-CSF分子量下降到25 kDa左右且弥散现象明显降低。用能专一性切割N-糖链的N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切GM-CSF蛋白,PNGaseF酶切后二者表达的GM-CSF分子量均降至20 kDa以下。说明这两种菌株表达的GM-CSF均发生不同程度的N-糖基化,其中野生型X-33表达的GM-CSF蛋白发生了过度、不均一的糖基化修饰; X-33(och1-)表达的GM-CSF糖基化修饰程度进明显降低,为低糖基化的蛋白,说明X-33(och1-)是一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的菌株。

毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF

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