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牡丹试管苗生根诱导过程中蛋白质表达变化的研究

作　者: 王海云
导　师: 何松林
学　校: 河南农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 牡丹试管苗生根蛋白质表达变化双向电泳
分类号: S685.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以洛阳牡丹品种‘乌龙捧胜’的鳞芽为外植体进行培养获得试管苗材料,初步建立了牡丹试管苗茎基部蛋白质组双向电泳技术体系,研究牡丹试管苗在生根诱导过程中的蛋白质表达变化情况,寻找与生根相关的蛋白,从蛋白分子水平上研究不定根的发生机理,为解决牡丹试管苗生根难问题奠定理论基础。本试验的主要研究结果如下:1.适合于牡丹试管苗茎基部的蛋白质提取方法为三氯乙酸/丙酮沉淀法。分别以三氯乙酸/丙酮法、乙酸铵/甲醇酚提取法、乙醇/乙醚丙酮法三种方法提取的蛋白,在相同的条件下进行双向电泳。通过对双向电泳图谱的比较,并应用ImageMaster软件进行分析,得出:用乙酸铵/甲醇酚提取法提取的蛋白质所得2-DE图谱的蛋白点很少,较模糊,且有明显的拖尾现象,分辨率很低,在胶面上仅检测到45个蛋白点;用乙醇/乙醚丙酮法提取的蛋白质所得2-DE图谱的蛋白点为101个,点数较少且模糊不清,分辨率低,横竖纹干扰较大;而用三氯乙酸/丙酮法提取的蛋白质所得点数较多,可检测到434个清晰的蛋白点,且清晰圆润,分布均匀,图谱质量较佳,适合后续分析。并且此法的重复性好,操作也较为简便。2.牡丹试管苗茎基部蛋白质的上样量为1200μg时,双向电泳效果较好。利用三氯乙酸/丙酮法提取的蛋白样品,选用长度为24cm、pH 3-10的IPG胶条以及12%的PAGE分离胶,在其它条件一致的情况下,三个不同上样量(800μg、1000μg、1200μg)的双向电泳结果为:上样量为800μg时,双向电泳图谱上蛋白点数较少且很模糊,分辨率很低,只检测到188个蛋白点;在上样量为1000μg时,蛋白点数(273)虽有所增加,但蛋白点依然较为模糊,分辨率不高;上样量为1200μg时,图谱上的蛋白点数明显增多,达到562个,蛋白点也比较清晰,分辨率较高,图谱质量明显优于其它两者。3.牡丹试管苗生根诱导过程中各个时期的蛋白质电泳结果表明:牡丹试管苗茎基部的蛋白质大部分属于酸性蛋白。大部分蛋白点集中在酸性端,等电点(pI)主要在4-7范围内,碱性端的蛋白质点较少。不同时期的蛋白质2-DE图谱有着很强的相似性,但也表现出一定的差异。在生根诱导前后和不同的诱导时期,蛋白质在表达点数和表达量上都存在着差异。但差异表达明显的蛋白质点主要为表达量上的差别。随着生根诱导培养时间的延长,表达量明显上调的有3个蛋白点,下调表达明显的为4个蛋白点,另有1个蛋白点在生根培养的第5d单独表达。4.用液质联用串联质谱仪(LC/ESI/ MS/MS)对所得的8个差异表达蛋白质点进行肽序列信息鉴定,根据MS/MS图谱信息与数据库检索,这8个蛋白点为同一种蛋白,同属于叶绿体中的ATP合成酶β亚基。ATP合成酶是植物光合作用和能量代谢过程中的关键酶,而β亚基是其结构的关键组成部分,是ATP合成的催化位点。推测其表达量的变化与不定根发生过程中复杂的能量代谢有关。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-25
  1.1 牡丹组织培养概述  9-14
    1.1.1 不同外植体的培养  9-12
      1.1.1.1 鳞芽培养  10
      1.1.1.2 茎尖培养  10-11
      1.1.1.3 叶及叶柄培养  11
      1.1.1.4 胚及胚珠培养  11-12
      1.1.1.5 花药、花粉培养与体细胞胚发生  12
    1.1.2 牡丹试管苗生根培养研究  12-14
      1.1.2.1 基本培养基类型对牡丹试管苗生根的影响  12-13
      1.1.2.2 生长调节物质对试管苗生根的影响  13
      1.1.2.3 环境条件对牡丹试管苗生根的影响  13-14
  1.2 不定根发生机理研究  14-18
    1.2.1 内源激素水平与不定根发生  15-16
    1.2.2 酶活性与不定根发生  16-17
    1.2.3 基因调控与不定根发生  17
    1.2.4 与不定根发生相关的蛋白质  17-18
  1.3 植物蛋白质组学研究进展  18-25
    1.3.1 蛋白质组学研究技术  19-20
      1.3.1.1 双向凝胶电泳技术  19
      1.3.1.2 质谱技术  19-20
    1.3.2 植物蛋白质组学研究进展  20-25
      1.3.2.1 植物组织器官发育蛋白质组研究  21-22
      1.3.2.2 植物响应胁迫蛋白质组学研究  22-24
      1.3.2.3 植物亚细胞蛋白质组学研究  24-25
2 引言  25-26
3 材料与方法  26-32
  3.1 材料、仪器和试剂  26
    3.1.1 材料  26
    3.1.2 仪器  26
    3.1.3 试剂  26
  3.2 方法  26-32
    3.2.1 蛋白质提取方法  26-28
      3.2.1.1 三氯乙酸/丙酮法  26-27
      3.2.1.2 乙酸铵/甲醇酚提取法  27
      3.2.1.3 乙醇/乙醚丙酮法  27-28
    3.2.2 蛋白质的裂解  28
    3.2.3 蛋白质样品浓度测定  28-29
      3.2.3.1 标准溶液OD 值的测定  28
      3.2.3.2 绘制标准曲线  28-29
      3.2.3.3 样品蛋白质含量计算  29
    3.2.4 第一向等电聚焦电泳（IEF）  29-30
    3.2.5 第二向SDS-PAGE 电泳  30-31
    3.2.6 胶体染色  31
    3.2.7 图像的扫描与分析  31
    3.2.8 质谱测肽序列信息鉴定蛋白  31
    3.2.9 数据库查询和蛋白质信息分析  31-32
4 结果与分析  32-37
  4.1 三种蛋白提取方法的结果比较  32-33
  4.2 蛋白质不同上样量的结果比较  33-34
  4.3 生根诱导时期茎基部蛋白质的2-DE 图谱比较  34-35
  4.4 差异表达蛋白点的质谱鉴定  35-37
5 结论与讨论  37-41
  5.1 蛋白质提取方法的比较  37
  5.2 蛋白质上样量的确定  37-38
  5.3 ATP 合成酶β亚基的功能以及与不定根发生的关系  38-41
    5.3.1 ATP 合成酶β亚基的功能  38-40
    5.3.2 ATP 合成酶β亚基与不定根发生的关系  40-41
参考文献  41-51
ABSTRACT  51-53
附图  53

牡丹试管苗生根诱导过程中蛋白质表达变化的研究

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