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唾液酸黏附素胞外区结构域的原核表达及抗体活性研究

作　者: 范旭
导　师: 夏平安；崔保安
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 唾液酸黏附素结构域 PRRSV PAM细胞免疫活性
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是目前引起猪繁殖障碍的主要病原之一,在猪体内主要感染猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)。与PRRSV感染相关的受体主要有唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)、硫酸乙酰肝素(Heparin su1phate,HS)和CD163分子受体。Sn受体可以黏附PRRSV并介导PRRSV的内吞作用。本文通过原核表达Sn胞外区结构域重组蛋白及检测重组蛋白抗体活性,为研究结合PRRSV的Sn受体胞外区结构域的功能作用打下基础。本试验从健康猪肺收集PAM细胞,提取PAM细胞总RNA,分析Sn受体基因胞外区结构域,用RT-PCR方法扩增出三个结构域的基因片段,大小分别为1755bp、1773bp、1620bp,将这三个基因片段分别亚克隆到PMD18-T载体中,进行序列测定。利用DNAStar软件分析了三个结构域的拼接序列与Genbank上发表的Sn受体胞外区核苷酸序列的同源性,结果为99.1%～99.5%。根据唾液酸黏附素受体基因序列,设计了3对5’端带有EcoRⅠ酶切位点,3’端带有NotⅠ酶切位点的特异表达引物。根据设计的引物扩增出三段基因,大小分别为1755bp、1773bp和1620bp。将所扩增出的基因片段分别亚克隆到原核表达载体pET32a中,构建了重组表达质粒PET-dSn1, PET-dSn2, PET-dSn3。在IPTG的诱导下成功表达,获得了分子量大小分别约为58KD、59KD、54KD的重组蛋白rdSn1、rdSn2和rdSn3,与预期的蛋白分子量相符;通过优化表达条件,大量表达重组蛋白,用尿素法对表达的蛋白进行纯化与复性。纯化重组蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,目的蛋白的纯度分别达到85%、76%、87%。用3种纯化蛋白分别免疫小鼠,制备抗重组蛋白rdSn1、rdSn2和rdSn3的多克隆抗体,经间接ELISA检测,效价均为1:400。将特异性多抗做免疫印迹,结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合,表明表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。在24孔细胞培养板上培养PAM细胞,24 h后分别将抗rdSn1、rdSn2、rdSn3血清及其混合血清加入PAM细胞,封闭1 h后接种PRRSV,培养72 h后用RT-PCR检测PAM中PRRSV。同时用健康鼠血清封闭PAM细胞作阴性对照,用PBS封闭PAM细胞作阳性对照。结果显示三种血清及其混合物均不能有效阻止病毒感染,表明PRRSV进入PAM细胞的过程中可能不完全依赖Sn受体胞外区结构域。

全文目录

致谢  4-6
中文摘要  6-7
文献综述  7-20
引言  20-21
试验一唾液酸黏附素胞外区结构域基因的克隆与序列分析  21-34
  1 材料与方法  21-30
  2 结果与分析  30-32
  3 讨论  32-34
试验二重组唾液酸黏附素胞外区蛋白的原核表达及其免疫活性研究  34-52
  1 材料与方法  34-42
  2 结果与分析  42-49
  3 讨论  49-52
试验三唾液酸黏附素抗体活性的初步研究  52-60
  1 材料与方法  52-54
  2 结果  54-57
  3 讨论  57-60
全文总结  60-61
参考文献  61-68
Abstract  68-70
发表论文  70

唾液酸黏附素胞外区结构域的原核表达及抗体活性研究

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