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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白重组腺病毒的构建及生物学活性分析

作　者: 高博
导　师: 吴健敏；扈荣良
学　校: 广西大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征 GPS蛋白 M蛋白重组腺病毒
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 29次
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起以怀孕猪繁殖障碍及仔猪呼吸道症状为主要特征的一种免疫抑制性传染病。由ORF5编码的GP5蛋白可以诱导机体产生中和抗体,是最主要的保护性抗原；M蛋白是PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白,具有很强的免疫原性,与细胞免疫有关。基于此,本研究将二者作为构建重组活载体疫苗的候选基因。本研究采用RT-PCR从实验室保存的PRRSV毒种中扩增出GP5和M基因,并将测序正确的基因分别定向克隆至真核表达载体pIRESneo的多克隆位点和neor基因处(替代neor基因),构建中间真核表达载体pIRES-GP5-M。以MluⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切pIRES-GP5-M,将包含有GP5和M基因的串联表达盒定向克隆至腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA多克隆位点处,构建重组腺病毒穿梭质粒rpacAd5 CMVK-NpA-GP5-M。PacⅠ线性化重组穿梭质粒rpacAd5 CMVK-NpA-GP5-M,与限制性内切酶消化的骨架质粒pacAd59.2-100共转染293AD细胞,包装出重组腺病毒并命名为rAd5v-GP5-M。运用PCR技术对重组.病毒进行了初步鉴定,结果表明GP5和M基因被成功整合到腺病毒基因组上；滴度测定表明该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/ml；间接免疫荧光试验和Western Blot分析表明,GP5和M蛋白均在293AD细胞上得到了表达。此研究为PRRS重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩写词表  10-12
前言  12-13
绪论  13-33
  1. PRRS和PRRSV的研究进展  13-23
    1.1  13-15
      1.1.1 PRRS的起源  13
      1.1.2 PRRS的流行病学  13-14
      1.1.3 PRRS诊断和防治  14-15
    1.2 PRRSV的研究进展  15-23
      1.2.1 基因组结构  17-20
        1.2.1.1 主要结构蛋白  17-19
        1.2.1.2 次要结构蛋白  19-20
      1.2.2 PRRS的免疫学  20-21
      1.2.3 PRRSV的变异  21-22
      1.2.4 PRRSV的致病机理  22-23
      1.2.5 PRRSV的抗体依赖性增强作用  23
  2 PRRS的疫苗研究进展  23-29
    2.1 常规疫苗  23-25
      2.1.1 灭活疫苗  23-24
      2.1.2 弱毒疫苗  24-25
    2.2 新型疫苗  25-29
      2.2.1 亚单位疫苗  25
      2.2.2 核酸疫苗  25-28
      2.2.3 活载体疫苗  28-29
  3 腺病毒及腺病毒载体的研究进展  29-33
第一章重组真核表达质粒pacAd5 CMVK-NpA-GP5-M的构建  33-47
  1 材料和方法  33-47
    1.1 材料  33-34
      1.1.1 病毒、细胞及菌株  33
      1.1.2 主要试剂  33
      1.1.3 主要仪器  33-34
    1.2 方法  34-46
      1.2.1 PRRSV的培养  34
      1.2.2 PRRSV总RNA的提取  34
      1.2.3 GP5和M基因的扩增  34-37
        1.2.3.1 引物设计  34-35
        1.2.3.2 RT-PCR扩增  35
        1.2.3.3 DNA连接  35
        1.2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  35-36
        1.2.3.5 DNA转化  36-37
      1.2.4 重组子鉴定  37-39
      1.2.5 重组真核表达载体的构建  39-41
        1.2.5.1 重组真核表达载体pIRES-GP5-M的构建  39-41
      1.2.6 试验结果  41-46
        1.2.6.1 重组穿梭质粒的构建  41-46
    1.3 讨论  46-47
第二章重组病毒的获得、鉴定及部分生物学活性分析  47-56
  2 材料和方法  47-56
    2.1 材料  47
      2.1.1 细胞,毒株  47
      2.1.2 主要试剂  47
      2.1.3 主要仪器  47
    2.2 试验方法  47-51
      2.2.1 转染  47-48
      2.2.2 重组病毒的获得  48
      2.2.3 重组病毒的纯化  48
      2.2.4 重组病毒的鉴定  48-50
      2.2.5 重组病毒生物学活性鉴定  50-51
        2.2.5.1 病毒TCID_(50)测定  50-51
        2.2.5.2 遗传稳定性分析  51
    2.3 试验结果  51-55
      2.3.1 重组病毒的获得  51
      2.3.2 电镜观察  51-52
      2.3.3 重组病毒的PCR鉴定  52
      2.3.4 间接免疫荧光  52-53
      2.3.5 Western Blot分析  53-54
      2.3.6 TCID_(50)的测定  54
      2.3.7 连续传代重组病毒的遗传稳定性检测  54-55
    2.4 讨论  55-56
全文总结  56-57
参考文献  57-63
致谢  63
攻读学位期间发表论文情况  63
附录: 主要试剂的配置  63-65

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白重组腺病毒的构建及生物学活性分析

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