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一株北极Marinomonas sp. BSi20414β-半乳糖苷酶的酶学性质及酶基因的克隆表达研究

作　者: 曾倩
导　师: 陈波
学　校: 华东理工大学
专　业: 海洋生物学
关键词: β-半乳糖苷酶 纯化 酶学性质 基因克隆与表达
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究从来源于北极的样品中筛选出一株p-半乳糖苷酶活性较高的菌株BSi20414,通过菌株形态、生理生化和16S rDNA研究,鉴定该菌株属于海单胞菌属(Marinomonas)。通过培养条件优化,确定了有利于BSi20414菌株产p-半乳糖苷酶的培养条件。进一步对BSi20414菌株所产的p-半乳糖苷酶进行了纯化和酶学性质研究,经过硫酸铵沉淀和离子交换层析两步纯化,分离纯化出电泳纯的β-半乳糖苷酶,分子量约为76KDa。对纯化的p-半乳糖苷酶酶学性质进行了详细研究,其最适酶活温度为60℃,热稳定性好,最适酶活pH为6.0,酶在pH为5.0-8.0范围内比较稳定。动力学分析表明在60℃水解ONPG底物时,km为13.465mmol/L, Vmax为1.072umol/L·min。该酶在水解底物时表现了明显的糖苷键键型特异性,HPLC分析显示其能够降解β-1-3糖苷键,不能降解p-1-4和p-1-6糖苷键。扩增β-半乳糖苷酶基因全长序列,命名为galm基因。将galm基因序列分别连接到pET-22b(+)和PGEX-4T-1载体,分别构建表达载体pET-galm和PGEX-galm,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,都获得了表达。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
第1章 综述  9-14
  1.1 β-半乳糖苷酶的特征  9
  1.2 不同来源β-半乳糖苷酶的酶学性质  9-10
    1.2.1 细菌制备β-半乳糖苷酶  9
    1.2.2 酵母菌制备β-半乳糖苷酶  9
    1.2.3 霉菌产生的β-半乳糖苷酶  9-10
    1.2.4 放线菌产生的β-半乳糖苷酶  10
  1.3 β-半乳糖苷酶结构和作用机理的研究  10-11
  1.4 β-半乳糖苷酶的应用现状  11-12
    1.4.1 β-半乳糖苷酶在食品工业中的应用  11
    1.4.2 β-半乳糖苷酶在环境保护中的应用  11-12
    1.4.3 β-半乳糖苷酶在医药方面的应用  12
    1.4.4 β-半乳糖苷酶在基因学中的应用  12
  1.5 基因工程技术在β-半乳糖苷酶生产中的应用  12-13
  1.6 本研究的目的和意义  13
  1.7 拟解决的主要问题  13-14
第2章 产β-半乳糖苷酶菌株的筛选、鉴定及其产酶条件的优化  14-27
  2.1 材料与仪器  14-16
    2.1.1 样品和菌株  14
    2.1.2 实验试剂  14
    2.1.3 培养基及其有关溶液的配置  14-15
    2.1.4 仪器设备  15-16
  2.2 实验方法  16-20
    2.2.1 产β-半乳糖苷酶菌株的分离和筛选  16-17
    2.2.2 菌株鉴定  17-19
    2.2.3 菌株产β-半乳糖苷酶发酵条件的优化  19-20
  2.3 结果与分析  20-25
    2.3.1 产β-半乳糖苷酶菌株的分离和筛选  20
    2.3.2 菌株鉴定  20-22
    2.3.3 菌株产β-半乳糖苷酶条件的优化  22-25
  2.4 小结与讨论  25-27
第3章 菌株β-半乳糖苷酶的纯化及酶学性质研究  27-42
  3.1 材料与仪器  27-28
    3.1.1 实验菌株  27
    3.1.2 实验试剂  27
    3.1.3 培养基及其有关溶液的配置  27-28
    3.1.4 主要实验仪器  28
  3.2 实验方法  28-32
    3.2.1 菌株β-半乳糖苷酶粗酶液的制备  29
    3.2.2 β-半乳糖苷酶活力的测定  29
    3.2.3 BSA标准曲线的绘制  29
    3.2.4 样品蛋白含量的测定  29
    3.2.5 β-半乳糖苷酶的分离纯化  29-30
    3.2.6 β-半乳糖苷酶的酶学性质  30-32
  3.3 实验结果  32-40
    3.3.1 β-半乳糖苷酶的分离和纯化  32-33
    3.3.2 β-半乳糖苷酶的底物特异性  33-34
    3.3.3 β-半乳糖苷酶的最适反应pH  34-35
    3.3.4 β-半乳糖苷酶的pH稳定性  35
    3.3.5 β半乳糖苷酶的最适作用温度  35-36
    3.3.6 β-半乳糖苷酶的热稳定性  36
    3.3.7 金属离子和化学物质对酶活的影响  36-37
    3.3.8 NaCl浓度对β-半乳糖苷酶酶活的影响  37
    3.3.9 β-半乳糖苷酶的NaCl耐受性  37-38
    3.3.10 β-半乳糖苷酶的动力学参数  38
    3.3.11 N-端测序结果  38-39
    3.3.12 β-半乳糖苷酶酶解所得产物的分析  39-40
  3.4 小结与讨论  40-42
第4章 β-半乳糖苷酶基因的克隆与表达  42-58
  4.1 材料和方法  42-43
    4.1.1 实验菌株  42
    4.1.2 工具酶和试剂  42
    4.1.3 培养基和相关溶液配置  42
    4.1.4 所用引物序列  42-43
  4.2 实验方法  43-48
    4.2.1 β-半乳糖苷酶基因的扩增  44-46
    4.2.2 原核重组表达质粒的构建  46-47
    4.2.3 β-半乳糖苷酶基因的大肠杆菌中的诱导表达  47
    4.2.4 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备  47-48
    4.2.5 抽提质粒  48
  4.3 实验结果  48-57
    4.3.1 β-半乳糖苷酶基因的扩增  48-51
    4.3.2 β-半乳糖苷酶基因序列分析  51-54
    4.3.3 原核重组表达质粒的构建  54-56
    4.3.4 β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达  56-57
  4.4 小结与讨论  57-58
第5章 总结  58-60
参考文献  60-64
致谢  64

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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