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肌纤维类型转化通路CαN/NFAT相关基因的表达分析及CAML基因的分离鉴定

作　者: 王建华
导　师: 雷明刚
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 信号通路肌球蛋白重链 CaN/NFAT CAML
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

动物体内的肌肉主要分为三类：骨骼肌,心肌和平滑肌,其中骨骼肌约占身体的40%-60%,而骨骼肌是由大量功能不同的纤维类型组成的。因此,猪肉中不同类型肌纤维的构成比例以及数量的差异,必将会影响肌肉的品质。在过去的研究中,已经形成了对肌肉纤维类型进行分类的较为成熟的方法,研究结果表明可将肌纤维分为四种类型,并用My(myosin heavy chain)Ⅰ,Ⅱa,Ⅱx以及Ⅱb来对不同类型纤维进行标记,且多项研究表明Ⅰ、Ⅱa型纤维含量比例的增大会使肉质朝偏好的方向发展。研究表明生物学通路CaN/NFAT对肌纤维类型的转化起到关键的作用。当细胞质中钙离子浓度增加并达到激活calcineurin的阈值时,能激活下游的转录因子,进而调节MyHCⅡb向Ⅱa型纤维转化。为了研究影响肌肉纤维类型的基因通路中基因表达规律,发现并分离差异表达基因,开展了CaN/NFAT通路中相关基因的表达规律研究以及通路中CAML基因的分离鉴定,结果如下：1、以120日龄大白,通城背最长肌为研究对象,比较了四种肌纤维类型在两个品种间的相对表达量。实验结果显示,MyHCⅠ,Ⅱa在大白中的表达量低于通城猪中的表达量,而MyHCⅡb在大白猪中的表达量高于通城猪。实验结果在一定程度上揭示了通城猪的肉质优于大白猪的原因。2、取大白猪同一个体的心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、脂肪、半腱肌、股二头肌、咬肌、背最长肌等组织,采用RT-PCR的方法,对通路各基因进行了组织表达谱分析。实验结果表明,各基因在各组织中广泛表达,这与CaN/NFAT通路广泛参与多项生理活动的事实是相符合的。3、运用实时定量PCR的方法,,检测了CaN/NFAT通路中5个基因在大白猪和通城猪出生后3天、21天、35天、60天、90天和120天六个不同生长发育阶段背最长肌的基因表达情况,结果表明在某些阶段品种间呈现显著或极显著差异。4、以120日龄大白背最长肌(快肌)和半腱肌(慢肌)为材料,比较了通路中各基因在快慢肌之间的相对表达量。结果显示,CAML,NFATc1在半腱肌中的表达量高于其在背最长肌中的表达量,而SERCA2a,CnAβ,MEF2D在背最长肌中的表达量较高。5、分离克隆了CAML基因的全部ORF以及部分5’和3’非翻译区共1683bp的cDNA序列,并对该基因编码的蛋白质序列进行了预测。对该基因编码的蛋白序列在不同物种间进行同源性比较的结果表明,猪的该蛋白序列与人,小鼠,大鼠,牛,猩猩,犬的相似性分别为91%,85%,82%,92%,91%,93%。6、对该基因的基因组序列扩增时,发现CAML第一内含子处存在310bp缺失。经过测序和序列比对分析发现可用PCR方法检测(CAML基因的该突变位点,并建立了CAML基因第一内含子插入／缺失的基因分型方法,三种基因型我们定义为Ⅱ,ID,DD。我们还对该基因突变位点在不同群体中的分布频率进行了比较,并在“大白×梅山”资源家系中进行了性状关联分析。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-13
资源系测定性状的英文缩写  13-14
1 前言  14-27
  1.1 猪肉品质评价与中外猪种肉质差异  14-16
    1.1.1 猪肉品质的评价指标  14-15
    1.1.2 中外猪种的肉质差异及影响因素  15-16
  1.2 骨骼肌肌纤维的分类及特点  16-19
    1.2.1 骨骼肌肌纤维的分类  16-17
    1.2.2 骨骼肌不同肌纤维类型的特点  17-19
  1.3 不同肌纤维类型与肉质的关系  19-21
    1.3.1 肌纤维类型与pH值  19
    1.3.2 肌纤维类型与嫩度  19-20
    1.3.3 肌纤维类型与系水力  20
    1.3.4 肌纤维类型与肌内脂肪含量  20
    1.3.5 肌纤维类型与肉色  20-21
  1.4 影响肌纤维类型转化信号通路 CaN/NFAT的介绍及研究进展  21-24
  1.5 对影响肌纤维类型及肉质特点的QTL定位研究  24-25
  1.6 研究的目的与意义  25-27
2 材料与方法  27-38
  2.1 试验材料  27-29
    2.1.1 试验样品  27
    2.1.2 主要试剂和试剂盒  27-28
    2.1.3 常用缓冲液和试剂配制  28-29
    2.1.4 主要仪器设备和耗材  29
    2.1.5 主要分子生物学软件和在线分析工具  29
  2.2 试验方法  29-38
    2.2.1 基因组DNA的提取  29-30
    2.2.2 从组织中提取总RNA  30-31
    2.2.3 cDNA第一链的合成  31-32
    2.2.4 实时定量PCR绘制基因表达变化  32-33
    2.2.5 PCR产物的回收、克隆和测序  33-36
    2.2.6 半定量RT-PCR分析组织表达谱  36
    2.2.7 CAML序列的研究  36-38
3 结果与分析  38-56
  3.1 猪组织总RNA提取  38
  3.2 大白通城猪肌肉中四种肌球蛋白重链亚型的相对表达量  38-39
  3.3 猪CaN/NFAT生物学通路相关基因的表达情况  39-44
    3.3.1 差异表达基因组织表达谱  39-40
    3.3.2 同一基因在大白和通城猪六个阶段的差异表达  40-42
    3.3.3 各基因在大白背最长肌和半腱肌中的相对表达量  42-44
  3.4 猪新基因CAML基因的序列分析、多态性分析及性状关联分析  44-56
    3.4.1 猪CAML基因cDNA全序列的克隆  44-45
    3.4.2 猪CAML基因cDNA序列及推导的氨基酸序列  45-47
    3.4.3 推导的猪CAML基因蛋白质的生物信息学分析  47-49
    3.4.4 CAML基因第一内含子突变位点的多态性检测  49-51
    3.4.5 CAML基因第一内含子突变位点不同基因型的建立  51
    3.4.6 CAML基因第一内含子突变位点不同基因型分布和等位基因频率  51-52
    3.4.7 CAML基因第一内含子突变位点遗传效应分析  52-56
4 讨论  56-62
  4.1 关于荧光实时定量方法的应用与讨论  56-57
  4.2 关于肌纤维类型与猪肉质之间的联系  57-58
  4.3 关于CaN/NFAT通路相关基因各阶段的表达差异  58-60
    4.3.1 差异表达基因的组织表达谱  58
    4.3.2 通路相关基因在不同阶段间的相对表达差异  58-59
    4.3.3 关于CaN/NFAT通路相关基因在不同肌肉中的表达差异  59-60
  4.4 关于基因CAML的序列分析  60
  4.5 CAML基因插入/缺失多态性检测与遗传效应分析  60
  4.6 下一步工作  60-62
5 结论  62-64
  5.1 本研究的主要结果与结论  62-63
  5.2 本研究的创新点  63-64
参考文献  64-72
致谢  72

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