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淫羊藿多糖的提取纯化、化学修饰及抗NDV活性研究

作　者: 金秧敏
导　师: 张秀英
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 淫羊藿多糖 NDV 提取纯化 硫酸化修饰 抗病毒
分类号: S853.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 103次
引　用: 1次
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内容摘要


新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)严重危害了各国养禽业的发展。目前国内外均采用疫苗免疫接种进行预防,尚无有效的治疗药物,而中药多糖在治疗新城疫疾病方面显示出巨大的潜力。本试验在初步筛选出的具有抗新城疫病毒活性的中药多糖的基础上,以淫羊藿多糖(Epimedium polysaccharide,EPS)为研究对象,开展了如下研究内容:在单因素考察的基础上,用正交实验优选EPS超声提取法和超声协同酶提取法的提取条件,超声提取法最优提取条件为:时间为50min,物料比为1∶20,温度为60℃;在该条件下采用苯酚-硫酸法测得EPS的提取率为24.12%,含量为0.56%;超声协同酶法所最优提取条件为:酶含量0.210g,时间为30min,pH值为9,温度为70℃,EPS提取率为45.23%,含量为1.06%。发现超声协同酶提取法优于超声波提取法。比较了Sevag法、反复冻融法、反复冻融结合Sevag法三种除蛋白的效果,选出最佳的方法是反复冻融结合Sevag法。用DEAE-52分离EPS可以得到两个洗脱峰。在对氯磺酸-吡啶体积比、反应时间、反应温度单因素考察的基础上,以SO42-含量和硫酸基取代度(DS)为指标,正交实验优选EPS的氯磺酸-吡啶法硫酸化修饰条件,所得最适硫酸化条件为:体积比为1∶6,反应时间为2.5h,反应温度为60℃;在该条件下所得多糖的SO42-含量为13.57%,DS为1.22。经紫外光谱分析,在190～220nm处有一强吸收峰,为多糖类物质吸收峰,在250~275nm之间有明显的-SO3的特征吸收峰。红外光谱分析结果表明硫酸酯化是成功的,EPS和硫酸酯化淫羊藿多糖(sulfated EPS,sEPS)均具有多糖母体的特征吸收峰,sEPS还有1259cm-1左右的S=O特征吸收峰和787cm-1左右的C-O-S特征吸收峰。体外细胞培养MTT法结果表明硫酸酯化后EPS的抗病毒活性有明显的提高,尤其是先加多糖后加病毒和病毒多糖同时加入这两种方式,EPS原来的抗病毒活性较低,硫酸酯化后活性显著提高。而sEPS可以干扰病毒对宿主细胞的吸附,影响病毒的释放而起到抗病毒的作用,还具有一定的直接杀灭病毒作用。本研究优化了EPS的提取条件,找到了合适的除蛋白方法,选择了适宜的硫酸化方法及条件,比较了EPS及sEPS抗新城疫病毒的活性,及初步探讨了抗新城疫病毒的机理。为中药多糖及硫酸酯化多糖在临床预防和治疗新城疫疾病研究提供一定的理论基础。

全文目录


中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-24
  1.1 淫羊藿的研究现状  11-13
    1.1.1 淫羊藿的种属及分布情况  11
    1.1.2 淫羊藿的化学成分  11-12
    1.1.3 淫羊藿的药理作用  12-13
    1.1.4 淫羊藿多糖  13
  1.2 多糖的研究现状  13-17
    1.2.1 多糖的提取纯化及含量测定  14-16
    1.2.2 多糖的生物活性  16-17
  1.3 多糖的硫酸酯化  17-22
    1.3.1 硫酸酯化多糖的制备  18
    1.3.2 硫酸酯化多糖的鉴定  18-19
    1.3.3 影响硫酸酯化多糖抗病毒活性的主要因素  19-20
    1.3.4 硫酸酯化多糖的抗病毒作用  20
    1.3.5 硫酸酯多糖的抗病毒作用机制  20-21
    1.3.6 硫酸酯多糖抗病毒作用的应用前景  21-22
  1.4 新城疫病毒防治的研究进展  22-23
  1.5 本研究的目的和意义  23-24
2 材料与方法  24-34
  2.1 试验材料  24-26
    2.1.1 材料  24
    2.1.2 试剂  24-25
    2.1.3 溶液的配置  25
    2.1.4 主要仪器  25-26
  2.2 试验方法  26-34
    2.2.1 淫羊藿多糖的提取  26-28
    2.2.2 除蛋白  28-29
    2.2.3 淫羊藿多糖的分离  29
    2.2.4 淫羊藿多糖的鉴定  29-30
    2.2.5 淫羊藿多糖的硫酸化修饰  30-31
    2.2.6 硫酸酯化淫羊藿多糖硫含量的测定  31
    2.2.7 硫酸酯化淫羊藿多糖的鉴定  31-32
    2.2.8 淫羊藿多糖及硫酸酯化淫羊藿多糖抗NDV 活性的研究  32-33
    2.2.9 数据处理  33-34
3 结果与分析  34-57
  3.1 多糖的提取及纯化  34-46
    3.1.1 硫酸-苯酚法测得葡萄糖的标准曲线  34
    3.1.2 超声波法单因素对多糖含量的影响  34-36
    3.1.3 超声波法正交设计试验结果  36-38
    3.1.4 超声协同酶法单因素对多糖含量和提取率的影响  38-40
    3.1.5 超声波协同酶法正交设计试验结果  40-42
    3.1.6 验证性试验结果  42
    3.1.7 除蛋白结果的比较  42-45
    3.1.8 淫羊藿多糖的分离曲线  45-46
  3.2 淫羊藿多糖硫酸化修饰结果  46-52
    3.2.1 硫酸根含量测定标准曲线  46
    3.2.2 单因素实验  46-47
    3.2.3 正交设计试验结果  47-49
    3.2.4 紫外光谱分析  49-51
    3.2.5 红外光谱分析  51-52
  3.3 多糖抗病毒效果的研究  52-57
    3.3.1 病毒毒力的测定  52-53
    3.3.2 EPS 和sEPS 对细胞的最大安全浓度的测定  53-54
    3.3.3 EPS 和sEPS 抗NDV 活性  54-57
4 讨论  57-65
  4.1 淫羊藿多糖提取及纯化  57-60
    4.1.1 淫羊藿多糖含量的测定  57
    4.1.2 淫羊藿多糖的提取  57-59
    4.1.3 淫羊藿多糖的纯化  59-60
  4.2 淫羊藿多糖硫酸化修饰  60-62
    4.2.1 硫酸根含量测定方法  60
    4.2.2 硫酸化修饰方法  60-61
    4.2.3 紫外光谱分析  61
    4.2.4 红外光谱分析  61-62
  4.3 淫羊藿多糖及硫酸酯化淫羊藿多糖的抗NDV 活性  62-65
    4.3.1 多糖安全浓度  62-63
    4.3.2 多糖抗病毒活性  63-65
5 结论  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-72
攻读硕士学位期间发表的学术论文  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 中国兽医学 > 中兽医药物学
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