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桑椹红色素的提取纯化及其抗氧化活性和稳定性研究

作　者: 朱毛毛
导　师: 吴向阳
学　校: 江苏大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 桑椹红色素提取纯化定性分析定量分析抗氧化稳定性
分类号: TS264.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

桑椹（Mulberry）俗称桑枣、桑果、桑实、桑子,为桑科桑属植物桑（Morusalba L.）的成熟聚花果,桑椹中含有大量的花色苷类色素,是一种很好的花青素类色素资源。桑椹花青素水溶性强,在碱性条件下呈蓝色,在酸性溶液中呈深紫红色,具有补血、润脑、利肝、利尿、抗氧化、抗突变、抗肿瘤等多种药理活性,因此桑椹红色素作为天然色素,越来越受到广大学者的关注。目前国外对桑椹红色素研究的相关报道较少,国内对桑椹红色素的研究主要集中在提取纯化工艺的研究上,对高纯度桑椹花青素的制备研究尚未见报道,因此本文着重研究桑椹红色素的分离纯化及抗氧化活性,为桑椹红色素的应用提供理论基础。本论文以冷冻桑椹为原料,对桑椹红色素的提取工艺、定性定量分析方法、纯化工艺、抗氧化活性和稳定性进行系统的研究,主要研究内容和结果如下:研究桑椹红色素的最佳提取工艺。采用溶剂提取法提取桑椹中的桑椹红色素,影响桑椹红色素得率的主要因素有温度、时间、液料比和提取液浓度,以最大吸收波长513nm下的吸光度值为考察指标进行单因素实验,考察单个因素对色素得率的影响;在单因素实验的基础上选择浸提温度、浸提时间、浸提液浓度、液料比为考察因素,以吸光度值为考察指标,进行正交试验,结果表明,桑椹红色素提取的最佳工艺条件为:温度50℃,提取时间90min,液料比15:1,浸提液浓度为40%（80%乙醇:0.1%HCl=1:1）,此时桑椹红色素提取物得率为102.6mg/g,验证试验表明此工艺稳定,可用于桑椹红色素的提取。研究桑椹花色苷的分析方法。本文分别采用四种定性方法—颜色反应、纸层析、薄层层析和紫外-可见光谱分析对桑椹红色素的主要成分—桑椹花色苷进行定性分析,通过四种定性方法分析初步判断桑椹红色素的主要成分为矢车菊-3-葡萄糖苷。桑椹红色素的定量分析方法主要有色价法、消光系数法、pH示差法和NaNO₂-Al（NO₃）₃比色法。分别采用四种定量方法对桑椹红色素进行定量分析。结果表明,纯化后色素的色价是纯化前的14.8倍,消光系数法测得桑椹红色素中花青素含量为0.015%,pH示差法测得其含量为0.017%,NaNO₂-Al（NO₃）₃比色法测得花青素含量为0.0076%。pH示差法是前人研究较为成熟的一种方法,相对较为准确、简便,优于其它方法。研究大孔树脂纯化的最佳条件。通过静态吸附和解析实验对四种大孔树脂—NKA、D101、AB-8和D1300进行筛选,分别计算其吸附率和解析率,结果表明,D101大孔树脂吸附率最高,为72.1%,解析率达68.5%,因此确定D101为本实验的最佳树脂。影响大孔树脂吸附的主要因素有料液浓度,料液pH及上柱速度,影响其解析效果的主要因素有洗脱液浓度、洗脱液体积和洗脱速度,分别进行动态吸附和动态解析的单因素实验,并在单因素实验的基础上进行吸附和解析的正交实验,分别以吸附量和解析率为考察指标对吸附和解析效果进行考察。通过大孔树脂吸附的单因素和正交实验可知最佳吸附条件为:料液浓度1.071Abs（以吸光度表示）,料液pH 3,上柱速度1mL/min;通过动态解析的单因素和正交实验得出大孔树脂的最佳解析条件为:洗脱液浓度80%（乙醇）,洗脱液体积2BV（柱体积）,洗脱速度1mL/min,此条件下的解析率为86.1%。用4BV的0.01%HCl洗脱大孔树脂柱,去除桑椹红色素粗提物中的糖类等可溶性杂质;用3BV的乙酸乙酯萃取三次,去除桑椹红色素中的脂溶性多酚类杂质,糖类杂质的去除率为100%,脂溶性多酚类杂质去除率为39.65%,得到桑椹红色素纯化液。对桑椹红色素纯化液进行HPLC-DAD-ESI-MS分析,可知该色素中至少含有14种不同的花青素,分别为天竺葵-3-葡萄糖,天竺葵-3-鼠李糖苷,天竺葵-3-芦丁苷,矢车菊-3-葡萄糖苷,矢车菊-3-芦丁槐糖苷,芍药花素-3-阿拉伯糖苷,矢车菊-3-芦丁苷,矢车菊-3-接骨木二糖苷,矢车菊-3-木糖芦丁苷,锦葵花素-3-葡萄糖苷,矢车菊-3阿拉伯糖苷,矮牵牛-3-葡萄糖芦丁苷,飞燕草-3,5-阿拉伯二糖苷,矮牵牛-3-葡萄糖苷。采用Sephadex LH-20对大孔树脂纯化后的桑椹红色素进行再纯化。配制不同浓度的酸性甲醇溶液（20%、40%、60%、80%）洗脱Sephadex LH-20柱,并分部收集,绘制洗脱曲线,得到三个组分:组分1、组分2和组分3;对组分1和组分2进行HPLC分析,组分1以矢车菊-3-葡萄糖苷为主（归一化分析结果表明占组分1色素的85.8%）,组分2以矢车菊-3-接骨木二糖苷为主（归一化分析结果表明占组分2色素的为78.5%）。桑椹红色素抗氧化实验表明,桑椹红色素粗提液清除自由基效果不明显;桑椹红色素纯化液对超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢自由基的清除能力较好,当浓度为40μg/mL时,纯化液对DPPH·的清除率已达到93.5%;纯化液对·OH的清除率随着溶液浓度的增加而增加,且桑椹红色素溶液对·OH的清除效果与Vc相当,当桑椹红色素溶液的浓度为600μg/mL时,其对·OH的清除率达到88.21%,Vc和桑椹红色素的IC₅₀值分别为123.25,132.25μg/mL;纯化液对O₂^-有一定的清除效果,但清除效果弱于Vc,Vc和桑椹红色素的IC₅₀值分别为304.94μg/mL和514.02μg/mL;桑椹红色素具有一定的油脂抗氧化效果,效果较对照品BHT差。桑椹红色素的稳定性实验表明:影响桑椹红色素稳定性的主要因素是pH,该色素在酸性条件下较稳定,颜色鲜艳,加热会使色素发生降解,稳定性下降;桑椹红色素对氧化剂比较敏感,较低浓度就会使大量色素降解,甚至褪至无色;金属离子Na⁺,Mg²⁺对色素稳定性影响不大,Fe³⁺,Cu²⁺对桑椹红色素的影响较大,使桑椹红色素变成蓝紫色。

桑椹红色素的提取纯化及其抗氧化活性和稳定性研究

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