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小鼠与猪胚胎干细胞分离培养

作　者: 赵颖
导　师: 周琪
学　校: 东北农业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 胚胎干细胞胚胎发育小鼠猪
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胚胎干细胞是一类具有在体外无限自我复制和分化为体内任何种类细胞的多潜能细胞。目前,公认的胚胎干细胞全能性判断标准包括:体内、体外向三胚层细胞分化和二倍体嵌合后能进入生殖脊。从1981年Kaufman MH等第一次分离小鼠胚胎干细胞至今,能满足这些标准的只有小鼠、大鼠和鸡的胚胎干细胞系。猪是重要的人类疾病模型动物、药物实验模型动物,同时还是人类异种器官移植的主要候选供体,其胚胎干细胞系的建立也一直受到广泛的关注,但是迄今为止真正的猪胚胎干细胞系(即满足上述判定标准)还未被建立起来。本实验首先采用改进的方法建立了小鼠胚胎干细胞系,然后以小鼠胚胎干细胞系建立的技术体系为基础,通过对猪早期胚胎发育的研究,对猪胚胎干细胞的建系技术以及分离得到真正猪胚胎干细胞的可能性等问题进行了探讨。主要的实验方法和实验结果如下:第一部分用KOSR胚胎干细胞培养液与FBS胚胎干细胞培养液结合的方式进行了ICR品系小鼠ESC的分离建系。结果表明,这种改进的建系方法不但可以用ICR品系小鼠的囊胚分离胚胎干细胞系,而且建系的效率高达71.4%。我们对得到的胚胎干细胞系中的一株进行了多能性的检测,实验数据表明该细胞系满足小鼠胚胎干细胞的鉴定标准。第二部分我们对猪早期胚胎进行了收集、形态观察、直径测量等实验。通过实验,我们收集了关于猪早期胚胎发育的一些数据,统计数据表明,猪早期胚胎的胎龄和其直径大小具有正相关的联系;同一批次的胚胎之间发育不同步的现象比较普遍,所以用胎龄对猪早期胚胎进行笼统的划分是不科学的。第三部分我们尝试了用猪体内、体外的胚胎进行分离胚胎干细胞的尝试。实验设计了三组培养液进行比较:KOSR胚胎干细胞培养液、FBS胚胎干细胞培养液、N2/B27胚胎干细胞培养液。统计结果表明,KOSR培养液更适合于体内胚胎分离胚胎干细胞。在优化的培养体系下,我们得到了人胚胎干细胞状的集落,并且传了三代。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-10
1 前言  10-19
  1.1 胚胎干细胞概述  10-13
    1.1.1 ESC 的概述  10-11
    1.1.2 各物种ESC 建系的进展  11-13
  1.2 猪胚胎干细胞分离培养研究进展  13-16
    1.2.1 猪ESC 建系的历史与现状  13-14
    1.2.2 影响猪ESC 建系的因素  14-16
  1.3 猪胚胎干细胞的鉴定  16-17
  1.4 本研究的目的意义  17-19
2. 材料与方法  19-27
  2.1 实验动物  19
  2.2 动物模型  19
    2.2.1 自然受孕小鼠  19
    2.2.2 猪的人工输精  19
  2.3 小鼠胚胎干细胞的分离方法  19-21
    2.3.1 饲养层的准备  19-20
    2.3.2 体内3.5 天囊胚的收集  20
    2.3.3 小鼠孤雌囊胚的收集  20
    2.3.4 小鼠胚胎干细胞的分离  20-21
  2.4 猪胚胎干细胞的分离  21-23
    2.4.1 饲养层的准备  21
    2.4.2 猪体内受精囊胚的收集  21-22
    2.4.3 猪孤雌囊胚的获得  22
    2.4.4 猪核移植囊胚的获得  22
    2.4.5 猪胚胎干细胞的分离  22-23
  2.5 胚胎干细胞的鉴定  23-26
    2.5.1 碱性磷酸酶染色  23
    2.5.2 免疫荧光实验  23-24
    2.5.3 核型分析  24-25
    2.5.4 胚胎干细胞体外分化――EB 的制备和培养  25
    2.5.5 小鼠核移植操作流程  25-26
    2.5.6 胚胎干细胞常规培养和冻存  26
  2.6 胚胎直径的测量  26
  2.7 统计方法  26-27
3 结果  27-38
  3.1 小鼠胚胎干细胞建系结果  27-32
    3.1.1 饲养层细胞的获得  27
    3.1.2 胚胎干细胞的分离、培养及建系  27-28
    3.1.3 小鼠胚胎干细胞生物学特性鉴定结果  28-32
  3.2 猪早期胚胎发育情况的研究结果  32-34
    3.2.1 猪早期胚胎的形态观察  32-33
    3.2.2 猪不同发育天数胚胎直径的比较  33-34
  3.3 猪胚胎干细胞建系的研究结果  34-38
    3.3.1 比较不同培养液对猪ESC 建系效果的影响  34
    3.3.2 猪体内来源胚胎的建系结果  34-36
    3.3.3 猪体外来源胚胎的建系结果  36-37
    3.3.4 猪体外囊胚的形态观察及细胞计数  37-38
4 讨论  38-42
  4.1 囊胚质量对ESC 建系的影响  38
  4.2 关于小鼠ESC 建系方法  38-39
  4.3 关于ESC 多能性的鉴定  39
  4.4 关于建立真正的猪ESC 细胞系  39-42
5 结论  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-49
附录  49-51
攻读硕士学位期间发表的论文  51

小鼠与猪胚胎干细胞分离培养

内容摘要

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