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一种新的鳗弧菌毒力相关因子MItD的功能研究

作　者: 徐子男
导　师: 张晓华
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 鳗弧菌 MltD蛋白 新的毒力相关因子 表达纯化 基因敲除
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种革兰氏阴性的嗜盐细菌,是世界范围内引起弧菌病的重要病原菌,给水产养殖业带来了严重的经济损失。在前期研究中,利用抑制性消减杂交技术建立了鳗弧菌毒力相关基因文库,并获得了一个255 bp的基因片段。为了探索此基因的生物学功能,在本研究中,应用LAPCR技术获得了此基因的序列全长。经过序列分析和同源比对,确定该基因可能编码一种膜绑定的具有溶解细胞壁功能的糖基转移酶MltD。生物信息学分析表明,鳗弧菌的MltD蛋白由523个氨基酸组成,其功能区包括N端的信号肽区域、一个糖基转移酶结构域SLT和C端的3个溶解酶结构域LysM,与大肠杆菌(Escherichia coli)的MltD蛋白结构比较相似,但是大肠杆菌的MltD蛋白由452个氨基酸组成,并且在C端只有2个溶菌酶结构域。据推测,鳗弧菌MltD蛋白的物理性质相对稳定,为亲水性蛋白；其N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白；整个分子具有较强的抗原性,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,与其它弧菌中预测的MltD蛋白有较高的序列相似性。推断该蛋白为一种外周膜脂蛋白,在弧菌内相对保守,抗原性强,可以作为抗弧菌病疫苗开发。应用表达质粒pET-32a (+)和表达菌株大肠杆菌BL21 (DE3)建立了mltD基因过量表达体系——大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-32a(+)/mltD。表达的MltD融合蛋白经尿素变性,通过镍-琼脂糖亲和柱纯化,经SDS-PAGE电泳检测证实,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论值相符。分别测定了纯化的MltD融合蛋白和经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-32a(+)/mltD的粗酶液的溶血活性、磷脂酶活性、明胶酶活性和淀粉酶活性,结果显示,纯化的MltD融合蛋白和经过诱导的大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-32a(+)/mltD的粗酶液都具有以上的酶活性,而作为对照的透析液和经过诱导的携带空载体的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-32a(+)的粗酶液都不具上述活性。依据同源重组原理成功构建了鳗弧菌CW-1的mltD基因突变株。对野生株和突变株进行性质研究发现：在胞外酶实验中,与野生株相比,突变株的明胶酶活性和胞外水解酶活性都显著降低,并且完全丧失了溶血活性；在抗高渗透压实验中,突变株的抗高盐高渗能力明显增强；而在偏酸或偏碱的环境中,突变株的适应能力降低；API 20E的结果显示,突变株失去了野生株原有的对葡萄糖的利用能力；而药敏实验中,突变株对菌必治、达复欣、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素和羧苄青霉素的敏感性显著降低,抗性增强。最为重要的是,在毒力研究中发现,突变株对腹腔注射感染的斑马鱼的半数致死量明显低于野生株,分别为1.01×102 CFU/尾和3.92×103CFU/尾；而对牙鲆鳃细胞的侵染速度,突变株也明显快于野生株,侵染1.5小时观察结果表明,突变株侵染细胞的脱壁比例明显高于野生株,与对斑马鱼的攻毒实验结果相一致,即鳗弧菌mltD基因突变株的毒力较野生株得到了增强。MltD基因的功能仅在大肠杆菌和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中报道过,在弧菌中仅发现存在同源序列。本研究首次报道了鳗弧菌中的mltD基因和由它编码的MltD蛋白具有致病相关性,并且对MltD蛋白的功能和在致病过程中的作用作出了推理。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-13
前言  13-24
  1 水产养殖业的发展现状  13-14
  2 鳗弧菌  14-21
    2.1 鳗弧菌的生物学性状  14
    2.2 鳗弧菌的流行病学  14-15
    2.3 鳗弧菌的主要致病因子  15-18
      2.3.1 毒力质粒(virulence plasmid)和摄铁系统(iron-sequencing system)  15-16
      2.3.2 溶血素(haemolysin)  16-17
      2.3.3 鳗弧菌的胞外金属蛋白酶(metalloprotease)  17
      2.3.4 外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)  17-18
      2.3.5 其他毒力因子  18
    2.4 近年来鳗弧菌的研究重点和热点  18-21
      2.4.1 鳗弧菌DNA文库的构建  18-20
      2.4.2 鳗弧菌的密度感应系统  20-21
  3 溶解细胞壁的糖基转移酶家族(LTs)和MltD  21-23
    3.1 溶解细胞壁的糖基转移酶家族  21-22
    3.2 膜绑定溶胞壁质转糖酶D(MltD)  22-23
  4 本论文研究的目的和意义  23-24
1 材料与方法  24-45
  1.1 菌株和质粒  24-25
  1.2 实验动物和细胞  25-26
  1.3 培养基  26
  1.4 试剂和仪器  26-27
  1.5 鳗弧菌菌株CW-1 mltD基因全序列的获得  27-34
    1.5.1 LAPCR的实验原理  27
    1.5.2 引物设计  27-28
    1.5.3 鳗弧菌基因组DNA的提取  28
    1.5.4 鳗弧菌基因组DNA的消化  28-29
    1.5.5 基因组片段与接头连接  29
    1.5.6 第一轮PCR反应  29-30
    1.5.7 第二轮PCR反应  30-31
    1.5.8 PCR扩增产物的检测及回收  31
    1.5.9 PCR扩增产物的连接反应  31
    1.5.10 感受态细胞的制备  31-32
    1.5.11 质粒转化感受态细胞及蓝白斑筛选阳性克隆  32
    1.5.12 重组质粒pUCm-T的提取和酶切鉴定  32-33
    1.5.13 序列拼接  33
    1.5.14 鳗弧菌VIB72的mltD基因全序列的获得  33-34
  1.6 鳗弧菌MltD蛋白的生物信息学预测  34
  1.7 鳗弧菌MltD蛋白的表达、纯化及活性研究  34-38
    1.7.1 鳗弧菌mltD基因表达载体的构建  34-36
    1.7.2 重组鳗弧菌CW-1的MltD融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE电泳检测  36
    1.7.3 重组鳗弧菌MltD融合蛋白的纯化  36-37
    1.7.4 Ni-NTA亲和层析柱的处理与再生  37-38
    1.7.5 重组鳗弧菌MltD融合蛋白的活性研究  38
  1.8 鳗弧菌mltD基因突变菌株的构建  38-42
    1.8.1 鳗弧菌菌株CW-1 mltD基因同源片段的克隆和鉴定  38-39
    1.8.2 构建重组自杀质粒pM2并转化结合菌株  39-40
    1.8.3 细菌接合实验  40-41
    1.8.4.PCR法鉴定鳗弧菌mltD基因突变株  41-42
  1.9 鳗弧菌mltD基因突变菌株性质的研究  42-45
    1.9.1 生长曲线的测定  42-43
    1.9.2 胞外酶活性  43
    1.9.3 API 20E检测  43
    1.9.4 药敏实验  43
    1.9.5 毒力实验  43-45
2 结果与分析  45-68
  2.1 MltD基因的全序列  45-46
    2.1.1 鳗弧菌CW-1 mltD基因的序列全长  45
    2.1.2 鳗弧菌VIB72 mltD基因的序列全长  45-46
  2.2 鳗弧菌MltD蛋白的生物信息学预测  46-52
    2.2.1 结构分析  46-47
    2.2.2 系统进化分析  47-48
    2.2.3 物理性质分析  48
    2.2.4 跨膜区域及信号肽预测  48-49
    2.2.5 抗原决定簇预测  49-50
    2.2.6 二级结构预测  50-51
    2.2.7 三级结构预测  51-52
  2.3 鳗弧菌MltD蛋白的表达、纯化及活性研究  52-57
    2.3.1 鳗弧菌mltD基因表达载体的构建及鉴定  52-53
    2.3.2 重组鳗弧菌CW-1的MltD融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达  53
    2.3.3 鳗弧菌MltD蛋白的纯化  53-54
    2.3.4 重组鳗弧菌MltD融合蛋白的活性研究  54-57
  2.4 鳗弧菌mltD基因突变菌株的构建  57-59
    2.4.1 mltD基因同源片段的的克隆和鉴定  57
    2.4.2 突变株的构建  57-58
    2.4.3 突变株的鉴定  58-59
  2.5 鳗弧菌mltD基因突变菌株性质的研究  59-68
    2.5.1 鳗弧菌野生株与mltD突变株生长曲线的测定  59-62
    2.5.2 胞外酶活性  62-64
    2.5.3 API 20E检测  64-65
    2.5.4 药敏实验  65
    2.5.5 毒力实验  65-68
3 讨论  68-71
4 小结  71-72
参考文献  72-82
附录Ⅰ 溶液配方  82-84
附录Ⅱ LAPCR获得的全部序列  84-86
致谢  86-87
个人简历  87
已发表和投稿的学术论文  87

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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