学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

三角紫叶酢浆草叶色变异株系的组织培养与RAPD和ISSR标记鉴定

作　者: 胡甦
导　师: 王永清
学　校: 四川农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 三角紫叶酢浆草叶色变异体细胞无性系变异组织培养 RAPD ISSR
分类号: S688.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 72次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本研究以三角紫叶酢浆草叶色变异株系为材料,研究其组织培养技术体系,并以野生型材料为对照,用RAPD和ISSR标记对其进行DNA检测鉴定。主要研究结果如下：1.形态发生能力：比较继代1次、5次和10次材料,叶片和叶柄的不定芽和愈伤组织的分化率均随继代次数增加而降低,不定根发生率随继代次数增加而升高。连续继代10次以内,选择叶片做外植体(培养物)更有利于保持相对稳定的愈伤组织和不定芽分化能力。2.增殖：TDZ能明显促进变异株系芽苗的增殖,增殖效果随其浓度增加而增加。一定量的TDZ能显著提高变异株系芽苗叶片花色素苷的积累。3.壮苗：适当提高不含生长调节物质的MS培养基中的磷、钾元素含量有利于芽苗的生长和叶片花色素苷的积累。当培养基中KH2PO4的浓度为680 mg/L(即4倍磷钾元素含量)时,试管苗的苗重、苗高和叶片数均达最大值。4.生根培养与鳞茎发生：NAA作用优于IBA,但两者配合使用效果最好。培养基中不加入6-BA有利于增加发根数和鳞茎数。最佳生根和鳞茎诱导配方均为：1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA0.2 mg/L(蔗糖40g/L,琼脂粉7g/L,pH5.8-6.0)。5.炼苗移栽：变异株系的生根苗和带根鳞茎的移栽成活率都很低,分别为2.56%和27.27%。6.蔗糖浓度对野生型和变异型材料叶片颜色的影响：三角紫叶酢浆草野生型和变异型材料的叶片颜色对蔗糖浓度变化都很敏感。(1)野生型叶绿素总量、叶绿素a含量、叶绿素b含量以及Chla/Chlb的比值均随蔗糖浓度提高而迅速升高；除Chla/Chlb比值有所下降外,上述其他指标数值均在蔗糖浓度高于30g/L后逐渐趋于稳定。变异型材料的叶绿素总量、叶绿素a、叶绿素b含量以及Chla/Chlb比值随蔗糖浓度升高均没有显著的变化。类胡萝卜素含量变化趋势与叶绿素基本一致。不同的是,变异型的类胡萝卜素含量也随蔗糖浓度提高而显著升高,但其增长幅度远低于野生型。相同蔗糖浓度下,变异型的上述所有色素指标的数值都远低于野生型。(2)野生型和变异型材料的花青素含量随蔗糖浓度增加而显著升高。蔗糖浓度为10-30g/L,野生型的增长速率大于变异型,超过30g/L后,野生型增长速率逐渐缓慢,而变异型出现并保持指数型增长趋势。7.采用改良CTAB法提取材料的DNA。优化了三角紫叶酢浆草的RAPD反应体系,首次建立并系统优化了三角紫叶酢浆草ISSR反应体系和扩增参数。优化后的RAPD反应体系为：反应液的总体积25μl, 10×Buffer 2.5μl, Mg2+浓度2.0 mmol/L, Taq酶1U,引物浓度0.3μmol/L, dNTP Mixture 0.25 mmol/L,模板DNA 80-100ng。RAPD-PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s,37℃退火1min,72℃延伸1.5min,40次循环；72℃延伸5 min；4℃保存。优化后的ISSR反应体系为：25μl反应液体系中含10×Buffer 2.5μl, Mg2+浓度1.25 mmol/L, Taq酶0.9U,引物浓度0.3μmol/L, dNTP Mixture 0.25 mmol/L,模板80ng。ISSR-PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性50s,退火时间60s(不同引物的退火温度不同),72℃延伸1.5min,40次循环；72℃延伸7min；4℃保存。8. RAPD和ISSR检测结果表明,在本研究涉及的引物检测范围内,变异株系继代5次与继代10次材料的基因组DNA扩增产物之间没有明显的差异,野生型花纹叶片材料与无花纹叶片材料的扩增结果之间也没有显著的差异。9.从70个RAPD随机引物和100个ISSR随机引物中分别筛选出2个RAPD特异引物(S76,S1t8)和2个ISSR特异引物(UBC818, UBC868),分别扩增出114和96个片段,多态性片段数为18和12,多态性百分率为15.79%和12.50%。其中差异性条带有5种,均能区分野生型和变异株系。变异株系的差异性缺失带S118 700-800测序结果序列包含编码叶绿体光系统Ⅰ第Ⅶ亚基的基因。证明了变异株系叶片颜色的变化的确与总基因组DNA的变化相关,变异株系叶绿素缺失性状可能与上述基因的缺失或者非正常表达有关。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩写词说明  10-11
前言  11
1 文献综述  11-18
  1.1 三角紫叶酢浆草的组织培养  11-14
    1.1.1 器官发生途径  12
    1.1.2 外植体  12-13
    1.1.3 生长调节物质对三角紫叶酢浆草组织培养的影响  13
    1.1.4 活性炭  13-14
    1.1.5 继代次数  14
    1.1.6 其他  14
  1.2 植物组织培养中发生的体细胞无性系变异简介  14-15
  1.3 RAPD和ISSR标记原理及其在植物无性系变异检测上的应用  15-18
    1.3.1 RAPD和ISSR的原理及特点  15-16
    1.3.2 RAPD和ISSR标记在植物无性系变异检测上的应用  16-18
  1.4 分子标记在酢浆草属植物中应用的概况  18
2 本研究目的和意义  18-19
3 材料与方法  19-31
  3.1 材料  19
  3.2 技术路线  19-20
  3.3 变异株系组织培养体系研究  20-24
    3.3.1 器官发生和无菌试管苗获得  20-21
    3.3.2 增殖  21
    3.3.3 壮苗培养  21-22
    3.3.4 生根培养与鳞茎诱导  22-23
    3.3.5 炼苗与移栽  23-24
  3.4 蔗糖浓度对野生型和变异型组培苗叶片颜色的影响  24-25
  3.5 变异株系的分子标记检测鉴定  25-31
    3.5.1 材料分类及试剂仪器  25-26
    3.5.2 材料总基因组DNA的提取  26
    3.5.3 RAPD-PCR反应  26-28
    3.5.4 ISSR-PCR反应  28-30
    3.5.5 数据统计与分析  30-31
4 结果与分析  31-59
  4.1 变异株系的组织培养  31-38
    4.1.1 变异株系的器官发生能力  31-32
    4.1.2 TDZ对变异株系增殖的影响  32-33
    4.1.3 壮苗培养  33-34
    4.1.4 生根培养与鳞茎发生情况  34-37
    4.1.5 炼苗与移栽  37-38
  4.2 野生型和变异型组培苗叶片颜色与蔗糖浓度的关系  38-40
  4.3 提取总基因组DNA的检测  40-41
  4.4 RAPD反应  41-47
    4.4.1 RAPD反应体系的优化  41-44
    4.4.2 RAPD引物筛选结果  44-45
    4.4.3 RAPD扩增结果和差异性条带  45-47
  4.5 ISSR反应  47-56
    4.5.1 ISSR反应体系的优化  47-52
    4.5.2 ISSR引物筛选结果  52-53
    4.5.3 ISSR扩增结果和差异性条带  53-56
  4.6 综合RAPD与ISSR两种分子标记的结果分析  56-57
  4.7 特异标记测序结果及分析  57-59
5 讨论  59-70
  5.1 长期继代对形态发生能力的影响  59-60
  5.2 蔗糖浓度对叶片颜色影响  60-61
  5.3 ISSR反应体系的建立与优化  61-63
  5.4 组织培养过程中无性系遗传物质的稳定性与可变性  63-65
  5.5 特异性片段与体细胞无性系变异的检测  65-66
  5.6 叶色突变及其原因  66-68
  5.7 进一步研究设想  68-70
参考文献  70-79
致谢  79-80
附图(Plate)  80-84

三角紫叶酢浆草叶色变异株系的组织培养与RAPD和ISSR标记鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文