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Decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究

作　者: 杨立峰
导　师: 叶定伟；姚旭东；张世林
学　校: 复旦大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 雄激素受体 LNcaP Decoy核酸 Akt
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的前列腺癌在接受内分泌治疗2年左右,约50%的患者出现激素抵抗,进展为去势治疗失败前列腺癌(CRPC)。即使在CRPC状态下,雄激素受体(AR)作为转录因子仍然持续激活下游基因的转录,产生PSA。通过雄激素受体反应元件陷阱核酸(ARE decoy DNA)在LNCaP细胞中作用,阻断AR激活,研究其对下游信号通路的影响。方法根据根据目前已知的位于PSA基因启动子-170附近的ARE-Ⅰ序列(AGAACAgcaAGTGCT)和位于PSA基因启动子-394附近的ARE-Ⅱ序列(GGATCAgggAGTCTC)，人工合成decoy核酸,并进行部分硫代和完全硫代修饰,同时双侧末端标记生物素或FITC。对照组核酸两端分别标记生物素或FITC。应用凝胶电泳阻抑分析方法(EMSA)检测4种人工合成的decoy核酸与LNCaP细胞核蛋白提取物特异性结合能力,模拟其与雄激素受体(AR)特异性结合情况。根据实验结果选取与核蛋白特异性结合最强的decoy核酸,通过脂质体Lipofectin2000进行细胞转染,转染后通过MTS法检测各组LNCaP细胞增殖能力；使用共聚焦显微镜观察转染前后细胞的形态学改变；通过提取转染后细胞内DNA,行水平电泳检查有无凋亡改变；通过western-blot检测转染后细胞内蛋白表达情况及信号通路改变。结果1凝胶电泳阻抑分析方法(EMSA):以1nM,10nM,100nM分别作为探针浓度,通过EMSA检测四种修饰过的decoy核酸,完全硫代的ARE-Ⅰ、ARE-Ⅱdecoy核酸相对于部分硫代修饰的ARE-Ⅰ、ARE-Ⅱdecoy核酸以及对照核酸,与LNCaP细胞核蛋白特异性结合能力更强,且探针浓度越高与核蛋白结合能力越强。完全硫代修饰后decoy核酸稳定性强于部分硫代修饰。2.细胞增殖试验：以2uM为decoy转染浓度,通过Lipofectin2000将四种修饰后decoy核酸转染入LNCaP细胞,转染率约为30%。转染24-72小时后,使用MTS法检测细胞增殖活性发现,完全硫代修饰的ARE-Ⅱdeoy相对于对照组核酸对LNCaP细胞增殖抑制效果最强(P小于0.01),在转染后48小时,完全硫代修饰的ARE-Ⅱdecoy核酸对LNCaP细胞的增殖抑制作用达到最强,到72小时后抑制作用逐渐减弱。3.细胞形态学观察：使用共聚焦显微镜观察转染前后细胞形态学改变,发现转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy后的LNCaP细胞,细胞核在DAPI染色下呈蓝色,细胞核内见绿色的荧光小点,为FITC标记的完全硫代ARE-Ⅱdecoy核酸,表明decoy核酸已转染进入细胞核内发挥作用,转染率为30%。转染后的细胞相对转染前,细胞数明显减少,细胞膜隆起,胞核明显皱缩,出现核染色质分块,呈现凋亡改变。4.DNA水平检测：提取转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy组,转染对照核酸组,以及正常LNCaP细胞内DNA,水平电泳发现转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy组,出现阶梯状的DNA ladder,表明转染后细胞发生凋亡改变,而对照组与空白组未出现上述改变。5. Western-blot检测蛋白水平改变：在LNCaP细胞中,转染前后Akt水平没有明显变化,但转染完全硫代ARE-Ⅱdecoy后细胞内的p-Akt表达明显降低,Akt信号通路被抑制,促进了细胞凋亡过程,同时转染后细胞内的PSA蛋白表达水平也较未转染前明显下降。结论完全硫代修饰的ARE-Ⅱdecoy核酸与雄激素受体结合能力最强,且完全硫代修饰的decoy核酸比部分硫代修饰的decoy核酸稳定性更强。转染完全硫代修饰的ARE-Ⅱdecoy核酸明显抑制LNCaP细胞的生长,促进细胞凋亡,抑制了细胞p-Akt蛋白的表达,使细胞内PSA蛋白水平明显下降,改变了细胞内信号通路。decoy核酸为今后治疗去势治疗失败前列腺癌(CRPC)提供了靶点。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
引言  8-11
材料与方法  11-24
结果  24-31
讨论  31-36
结论  36-37
参考文献  37-40
综述  40-44
表论文情况  44-45
致谢  45-46

Decoy核酸在LNCaP细胞中作用机制研究

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