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表达HBV病毒受体SCCAI及AnnexinV的HBV易感小鼠模型的建立

作　者: 李想
导　师: 尤平；陈红星
学　校: 陕西师范大学
专　业: 动物学
关键词: 乙肝病毒 乙肝病毒连接蛋白 膜连接素 转基因小鼠
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


乙肝病毒的主要被感染者是人类以及大猩猩等少数灵长类动物,过去对乙肝病毒的研究常受到制约是由于缺乏适宜并可行的实验动物作为模型。依据目前对乙肝病毒的研究,发现乙肝病毒的DNA只要进入寄主细胞,就不受感染组织和易感染物种的限制,这表明能够和乙肝病毒特异结合的受体与易感染者即宿主肝细胞表面结合的能力与感染范围的大小正相关。基于已有的关于乙肝病毒受体方面的研究,在若干可能的乙肝病毒受体中我们统计出最有可能的受体：乙肝病毒结合蛋白(HBV-Binding Protein)和人肝细胞结合蛋白又叫做膜连接素(AnnexinV)。根据细胞转染实验分析,结果表明,在表达了乙肝病毒受体的若干细胞中,乙肝病毒在细胞中的复制程度因为受体表达水平不同而不同。另外尚有研究人员发现某些细胞能天然的不被乙肝病毒感染,但病毒的感染和复制在转染表达受体后却发生了,且能够检测到病毒滴度。一种能够变更动物遗传信息的方法,可以使获取新的基因表达性的方法能够解决以上难题,因此出现了转基因动物。利用转基因的方法制作经济高效的动物模型为人病毒的防治与致病性研究提供了新的思路。本实验将已有的研究成果及对乙肝病毒受体的研究应用于制备AnnexinV的转基因小鼠和制备表达乙肝病毒受体BP,并尝试建立能同时表达两种基因的小鼠模型和乙肝病毒易感模型,实验方法如下：分别使用PCR方法扩增并获得Annexin V和BP的全长cDNA序列,此过程以质粒3140878和4101988为模板,将其连接到PCAGGS的真核表达载体,通过双酶切与PCR来进行筛选克隆,结果得到了两种基因的表达载体PCAGGS-BP和PCAGGS-AnnexinV。我们使用上述的两种表达载体,通过显微共注射的方法获得了44只小鼠,其中转基因小鼠有19只,基因组中整合有BP和AnnexinV的转基因小鼠的有12只。经过不断传代后利用PCR和Southern检测都证实12只转基因小鼠的基因组中的确有转入的两种基因的整合,转基因阳性率为27.2%,同时我们对鉴定了转基因小鼠系中外源性基因的表达,我们提取了转基因小鼠组织的总RNA,进行了RT-PCR的检测,结果表明两种转入的基因都能进行活跃转录,进一步的western-blot鉴定证实了两种转入基因的共表达。各个founder小鼠经过传代已建立各相应的转基因小鼠系。

全文目录


缩略词表  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-8
前言  8-11
第1章 HBV受体BP及AnnexinV基因的克隆与表达载体的构建  11-23
  1.材料  13-15
    1.1 菌株和载体  13
    1.2 生化与分子生物学试剂  13-15
    1.3 主要仪器  15
  2.方法  15-23
    2.1 质粒提取  15-17
    2.2 扩增和鉴定BP和AnnexinV基因用PCR引物的合成与基因测序  17-18
    2.3 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物的回收与纯化  18-19
    2.4 显微注射用转基因载体的构建  19-23
第2章 表达AnnexinV和BP易感小鼠模型的建立  23-45
  1.材料  24-27
    1.1 表达基因载体质粒  24
    1.2 限制性内切酶等相关试剂  24-25
    1.3 主要溶液  25-26
    1.4 实验动物  26-27
    1.5 实验用仪器  27
  2.方法  27-41
    2.1 制作显微注射片断  27-30
    2.2 显微注射转基因小鼠  30-33
    2.3 小鼠鼠尾基因组DNA的制备  33-34
    2.4 转基因小鼠的各种鉴定  34
    2.5 PCAGGS-AnnexinV+BP转基因小鼠的Southern杂交分析  34-37
    2.6 小鼠组织总RNA的提取  37
    2.7 RNA中微量DNA的去除  37-38
    2.8 RT—PCR检测转基因小鼠体内AnnexinV和BP的转录  38-39
    2.9 在蛋白水平上检测AnnexinV和BP转基因小鼠肝组织中的表达  39-41
  3.结果  41-44
    3.1 转基因载体注射片断的准备  41
    3.2 转基因载体的显微注射  41-42
    3.3 转基因小鼠的基因型鉴定  42-43
    3.4 RT—PCR检测转录情况  43-44
  4.总结  44-45
结论  45-46
参考文献  46-50
致谢  50-51
攻读硕士学位期间研究成果  51-52

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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