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罗格列酮对OLETF鼠糖尿病发病机制中IKK/NF-κB通路作用的初步研究

作　者: 李佳
导　师: 薛耀明
学　校: 第一军医大学
专　业: 内分泌与代谢病学
关键词: 罗格列酮 OLETF鼠 2型糖尿病肝脏胰腺 IKKβ NF-κB IRS-1
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

【背景】随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）已经成为严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。目前，糖尿病患病率在全球范围内呈逐年增高的趋势，给个人和社会带来巨大的经济负担。随着胰岛素、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂等药物的不断开发与应用，糖尿病的治疗有了更多的手段。尽管在糖尿病治疗领域取得了不断的进步，但目前临床上仍然缺乏有效的手段控制糖尿病及其并发症的发生与发展。预防糖尿病的发生，从根本上消除糖尿病带来的危害，成为最受人们关注的问题之一。糖尿病能否预防，什么是最为经济、安全、有效的预防手段成为亟待解决的问题。美国糖尿病预防试验（DPP）和STOP-NIDDM等循证医学研究表明，占全部糖尿病患者90％以上的T2DM是可以预防的，采取干预措施可以降低2型糖尿病发病危险31％～58％。T2DM的发病机制尚未完全阐明。目前认为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是T2DM最重要的两个发病因素，而胰岛素抵抗在T2DM的发病过程中有可能起始动作用并贯穿该病的全过程。因此，改善胰岛素抵抗对于预防和治疗T2DM至关重要。胰岛素抵抗是亚细胞、细胞、组织或机体的一种病理生理状态，本意指需要超过正常量的胰岛素始能在胰岛素的效应器官产生正常的生理效应，现代的胰岛素抵抗概念则泛指胰岛素在周围组织摄取和清除葡萄糖的作用减低，即指整体、器官或组织对胰岛素作用的反应性降低，其发生机制十分复杂。当机体出现胰岛素抵抗时，胰岛素刺激的葡萄糖利用减少，同时不能有效抑制肝糖原分解输出葡萄糖，从而导致血糖升高最终出现糖尿病。近年来，炎症及炎症介质在T2DM发病机制中的作用也日益引起学术界的关注。其中，核转录因子-κB（Nuclear transcription factor-kappaB，NF-κB）作为炎症启动、调节的关键核因子，是研究中的热点。但是NF-κB是如何调控炎症既而导致T2DM的发生的具体机制，以及炎症与胰岛素抵抗在T2DM发病中的相互关系目前尚未明确。国内外鲜见类似报道。故为更好的阐明T2DM的发病机制，进一步指导诊治，有必要探讨炎症与胰岛素抵抗的关系。目前，国内外已有文献报道，NF-κB抑制物激酶(（IκB kinase，IKK）是联系炎症与胰岛素抵抗的重要纽带。生理情况下，NF-κB与其抑制物IκB（Inhibitor of NF-kB）结合，以无活性的形式存在于细胞浆内，一旦IκB激酶IKK被肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-a，TNF-a）等炎症因子激活后，使IκB磷酸化并与NF-κB解离，解除抑制活性的NF-κB进入细胞核内，调节一系列炎症反应。即IKK是调节炎症的重要因素。同时IKK又是胰岛素受体和胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate，IRS）的丝氨酸磷酸化激酶，可使IRS 307位的丝氨酸磷酸化，导致正常的酪氨酸磷酸化受抑制、减弱胰岛素受体与IRS的结合、终止胰岛素信号向磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3-K）传递；而IRS的丝氨酸磷酸化还可以增加IRS的降解，并使IRS成为胰岛素受体激酶的抑制物。综上，IKK是将炎症和IR联系起来的重要枢纽。因此，在对糖尿病干预的研究中，探讨干预药物对IKK／NF-κB通路的影响，不仅对阐明胰岛素抵抗和炎症在T2DM的发病机制中的作用有着重要意义，对于阐明干预药物的作用机制也非常必要。罗格列酮（Rosiglitazone，RSG）作为一种新型的噻唑烷二酮类（Thiazolidinediones，TZDs）胰岛素增敏剂，在临床上已广泛应用于胰岛素抵抗和T2DM的治疗。其主要作用机制是通过竞争性激活过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）γ，提高肌肉及脂肪组织对胰岛素的敏感性，同时还可以减少肝糖的输出，在降低血糖、改善脂代谢、改善高胰岛素血症和改善胰岛素抵抗方面有重要作用。同时有研究证实，罗格列酮通过与PPAR-γ结合，激活PPAR-γ的生物学活性，起到抗炎作用，且其抗炎作用独立于降糖作用之外。提示该药对干预T2DM的进程可能有一定作用。故本实验以IKK／NF-κB通路为切入点，探讨罗格列酮对糖尿病大鼠胰岛素敏感器官中炎症和胰岛素抵抗的枢纽——IKK的干预作用，及其对T2DM的预防作用。为更好地观察罗格列酮通过IKK／NF-κB通路对T2DM的干预作用，本课题采用了国际标准的自发性T2DM大鼠模型之一雄性OLETF（Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty）鼠及其同种系糖耐量正常的LETO（Long-Evans Tokushima Otsuka）鼠作为观察对象，进行罗格列酮预防糖尿病的实验研究，通过观察其对OLETF鼠胰岛素作用的靶器官肝脏和胰腺的形态学及IKK／NF-κB通路的影响，探讨罗格列酮从胰岛素抵抗和炎症角度对T2DM发病干预作用的可能机制。具体研究分为以下两个部分：第一章罗格列酮对OLETF鼠胰岛素作用的靶器官—肝脏及胰腺的形态学影响【目的】通过观察罗格列酮对自发性T2DM大鼠模型OLETF鼠胰岛素作用的靶器官—肝脏及胰腺的形态学影响，探讨罗格列酮对T2DM发病的干预作用。【方法】1．以自发性T2DM大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性，共分三组。OLETF鼠干预组（干预组）和OLETF鼠对照组（对照组），每组20只；LETO鼠10只作为正常对照组（LETO组）。从8周龄开始，干预组予罗格列酮溶液灌胃(3mg·kg^-1d^-1)，其余两组以等量蒸馏水灌胃。2．分别于8周龄、32周龄和40周龄随机（玻璃珠法）处死大鼠。大鼠宰杀后分离肝脏及胰腺组织，并分别置于10％多聚甲醛中待检。3．以石蜡切片机间隔4um连续切片。相邻切片分别用标准HE染色观察大鼠肝脏及胰腺组织学改变。4．特殊染色：根据HE结果，对32周龄及40周龄的对照组及干预组大鼠肝脏以冰冻切片进行脂肪苏丹Ⅲ染色及淀粉酶消化前后的PAS染色，以进一步明确病变性质。【结果】1．8周龄时，各组大鼠胰岛结构无明显差别。32周龄，干预组和对照组胰岛明显比LETO组肥大，并有纤维组织长入，对照组大鼠胰岛纤维化更加明显，胰岛结构不整齐。40周龄，对照组大鼠胰岛形状更不规则，纤维组织大量增生，多数胰岛失去正常结构，胰岛明显萎缩。干预组大鼠胰岛基本保持正常结构，无明显肥大或萎缩，部分胰岛有内外分泌腺交错生长或明显的纤维化。2．8周龄时，各组大鼠肝脏结构亦无明显差别。32周龄，对照组及干预组大鼠肝细胞均出现明显空泡样变性，而LETO组大鼠肝小叶结构依然整齐，肝细胞以中央静脉为中心排列成索状。40周龄，对照组大鼠肝细胞空泡样变性更加明显，干预组较32周时改善，仍可见部分肝细胞空泡化。3．苏丹Ⅲ染色结果：32周龄，干预组及对照组肝细胞均出现明显的脂肪变性，其中对照组肝细胞以小泡性脂肪变性为主，而干预组则为大小泡混合性脂肪变性，同时可见大量脂滴沉积于胆小管中；40周龄时，干预组脂肪变性明显减轻，胆小管中脂滴沉积亦减少，而对照组进一步发展为大小泡混合性脂肪变性。4．淀粉酶消化前后的糖原特殊染色——PAS染色结果：32周龄，PAS染色对照组及干预组肝细胞的胞质及胞核均可见丰富的红色颗粒，经过淀粉酶消化后PAS染色阴性，证明红色颗粒均为糖原颗粒；40周龄，对照组肝细胞中红色颗粒更加丰富，而干预组肝细胞中红色颗粒明显减少，经淀粉酶消化后染色阴性证实为糖原。【结论】1．罗格列酮能够通过保护OLETF大鼠胰岛及肝脏的正常形态结构，达到维持胰岛素作用的靶器官的生理功能作用；2．OLETF大鼠肝脏随着糖尿病病程进展，脂肪浸润及糖原累积逐渐加重；3．罗格列酮的短期应用，对改善OLETF大鼠肝脏的脂肪浸润及糖原累积影响不大；长期应用，可改善OLETF大鼠肝脏的脂肪及糖原堆积。第二章罗格列酮对OLETF鼠IKK／NF-κB通路的影响【目的】通过罗格列酮的早期干预，观察罗格列酮对OLETF鼠IKK／NF-κB通路的影响以及胰岛素敏感性相关指标的影响，从抗炎角度探讨罗格列酮对改善OLETF鼠胰岛素抵抗的影响及其机制。【方法】1．实验动物、分组和干预措施同第一部分2．取液氮中的肝脏及胰腺标本，提取总蛋白，以免疫印迹（Westernblot，WB）方法测量组织中IKKβ的蛋白表达情况，凝胶图像分析系统观察结果，检测各组目标蛋白条带的灰度值，并计算目标条带与内参β-actin条带的灰度比值，观察IKKβ的蛋白表达情况3．取第一部分中已处理的各组大鼠的肝脏和胰腺组织蜡块，以石蜡切片机间隔4um连续切片。相邻切片用免疫组化法标记NF-κB阳性细胞，用凝胶图像分析系统观察结果，用阳性单位（Positive Unit，PU）表示NF-κB在各组大鼠肝脏及胰腺的表达情况。4．同法，石蜡切片机连续切片后，相邻切片用免疫组化法标记IRS-1阳性细胞，通过凝胶图像分析系统，用PU表示IRS-1在各组大鼠肝脏及胰腺的表达情况。5．分析IKKβ、NF-κB及IRS-1的相关性6．实验数据计量资料以均数±标准差（（?）±s）。采用SPSS10.0软件进行统计分析，两样本间计量资料的比较采用t检验。多组间资料比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验。各因子之间的双变量相关性采用等级相关系数（Spearman秩相关系数）的非参数方法。【结果】1、罗格列酮对OLETF大鼠肝脏中IKKβ表达的影响各组IKKβ的表达都随周龄延长而增加，且这种差异有统计学意义。同周龄各组间的横向比较，8周龄时，对照组IKKβ表达已高于LETO组（P＜0.001）。32周龄时，对照组IKKβ表达显著高于LETO组和干预组（P＜0.001）；与LETO组相比，干预组IKKβ表达情况无显著差别（P=0.188）。40周龄时，IKKβ表达仍然是在对照组最高，干预组其次，LETO组最低，差异有统计学意义（P＜0.001）。2、罗格列酮对OLETF大鼠胰腺中IKKβ表达的影响随着周龄的延长，对照组IKKβ的表达逐渐增加，32周龄和40周龄时较8周龄显著升高（P＜0.001）。LETO组和干预组则未见此趋势。8周龄时，对照组IKKβ蛋白表达高于LETO组，差异有统计学意义（P=0.002）。32周龄时，IKKβ蛋白的表达在对照组最高，干预组其次，LETO组最低，其中对照组与干预组的差异无统计学意义（P=0.175）。40周龄时，IKKβ表达依然是在对照组最高，干预组其次，LETO组最低，且各组间的差异均有统计学意义（P＜0.001）。3、罗格列酮对大鼠肝脏NF-κB表达的影响干预组随着周龄的延长，NF-κB的表达增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对照组随着周龄延长，NF-κB的表达增加更加显著（P＜0.001）。在LETO组中则无此趋势。同周龄各组间比较，8周龄时，对照组NF-κB的表达即显著高于LETO组（P=0.002）。32周龄时，与LETO组相比，对照组NF-κB的表达水平显著升高，干预组次之，各组间差别有统计学意义（P＜0.001）。40周龄时，对照组NF-κB的表达进一步升高，显著高于干预组和LETO组，干预组仍然介于对照组和LETO组之间，各组间差异有统计学意义（P＜0.001）。4、罗格列酮对OLETF鼠胰腺NF-κB表达的影响各组NF-κB均随周龄延长而增加，对照组内不同周龄的NF-κB表达有显著性差异（P＜0.01），LETO组40周龄时显著较8周龄、32周龄增高（P＜0.002），其余各组内不同周龄间差异无统计学意义（P＞0.05）。同周龄各组间比较，8周龄时，对照组胰腺中NF-κB的表达就开始显著高于LETO组（P=0.005）；32周龄时，与LETO组大鼠相比，对照组和干预组NF-κB的表达量均显著增高（P＜0.008）；干预组低于对照组，但差异无统计学意义（P=0.082）。40周龄时，对照组和干预组胰腺中NF-κB表达量仍然都显著高于LETO组（P＜0.003）；干预组胰腺中NF-κB表达量仍低于对照组，但差异无统计学意义（P=0.060）。5、罗格列酮对大鼠肝脏IRS-1表达的影响LETO组IRS-1的表达量随着周龄的延长而增加，但这种变化无统计学意义（P=0.590）。对照组IRS-1在肝脏的表达32周时高于8周龄（P=0.049）及40周龄（P=0.001）。干预组IRS-1随着周龄延长呈下降趋势，但差异无统计学意义（P=0.748）。同周龄各组间比较，8周龄时，LETO组IRS-1的表达即显著高于对照组（P=0.002）。32周龄时，IRS-1在肝脏的表达在LETO组最高，干预组次之，对照组最低，差异显著（P＜0.001）。40周龄时，LETO组IRS-1的表达进一步升高，显著高于干预组和对照组，对照组则呈下降趋势，仍在三组中表达最低，各组间差异有统计学意义（P＜0.001）。6、罗格列酮对OLETF鼠胰腺IRS-1表达的影响LETO组IRS-1的表达在各时间段差异显著（P＜0.001），其中32周龄最高，40周龄次之，但32周龄和40周龄间差异无统计学意义（P=0.504）。对照组中IRS-1的表达随着周龄的延长变化不显著（P=0.738）。干预组IRS-1的表达在不同周龄间的差异亦无统计学意义（P=0.167）。8周龄时，LETO组IRS-1在胰腺中的表达即显著高于对照组（P＜0.001）。32周龄时，对照组显著低于LETO组和干预组，干预组低于LETO组，各组间差异具有统计学意义（P＜0.001）。40周龄时，IRS-1在LETO组最高，干预组次之，对照组最低，差异有统计学意义（P＜0.001）。7、肝脏中IKKβ、NF-κB与IRS-1的相关性分析相同周龄时，肝脏中IKKβ、NF-κB与IRS-1的相关分析结果：8周龄，IKKβ与NF-κB的表达呈正相关，相关性显著（r=1.000，P＜0.001），IKKβ、NF-κB均与IRS-1呈负相关，相关性不显著（P=0.208）。32周龄时，IKKB与NF-κB的呈显著正相关（r=0.850，P＜0.001），IKKβ与IRS-1呈负相关（r=-0.75，P=0.02），NF-κB与IRS-1呈显著负相关（r=-0.867，P=0.002）。40周龄时，IKKβ与NF-κB的仍呈显著正相关（r=0.933，P＜0.001），且均与IRS-1显著负相关（P＜0.001）。同一因子，随大鼠周龄的增长与其他因子之间的关联：IKKβ与NF-κB在大鼠8周龄、32周龄、40周龄均呈显著正相关关系，分别为8周龄（r=1.000，P＜0.001）、32周龄（r=0.850，P=0.004）、40周龄（r=0.933，P＜0.001）。IKKβ与IRS-1在以上三个时间段均呈负相关，其中在32周龄和40周龄时相关性有统计学意义。NF-κB与IRS-1在8、32、40周龄亦呈负相关，在32和40周龄相关性具有统计学意义。8、胰腺中IKKβ、NF-κB与IRS-1的相关性分析相同周龄时，胰腺中IKKβ、NF-κB与IRS-1的相关分析结果：8周龄，IKKβ与NF-κB的表达呈显著正相关（r=1.000，P＜0.001），均与IRS-1呈负相关，相关性不显著（P=0.208）。32周龄时，IKKβ与NF-κB的呈正相关，相关性显著（r=0.983，P＜0.001），IKKβ与IRS-1呈显著负相关（F=-0.800，P=0.01），NF-κB与IRS-1呈负相关（F=-0.75，P=0.02）。40周龄时，IKKβ与NF-κB的仍呈显著正相关（r=0.933，P＜0.001），且均与IRS-1显著负相关（P＜0.001）。同一因子，随大鼠周龄的增长与其他因子之间的关联：IKKβ与NF-κB在大鼠8周龄、32周龄、40周龄均呈显著正相关关系，分别为8周龄（r=1.000，P＜0.001）、32周龄（r=0.983，P＜0.001）、40周龄（r=0.933，P＜0.001）。IKKβ与IRS-1在以上三个时间段均呈负相关，其中在32周龄和40周龄时相关性有统计学意义。NF-κB与IRS-1在8、32、40周龄亦呈负相关，同样在32和40周龄时，相关性具有统计学意义。【结论】1．罗格列酮早期干预能降低OLETF鼠IKKβ、NF-κB的表达，从炎症启动的上游因子开始减轻炎症反应对胰岛素作用的靶器官肝脏和胰腺的损害。2．罗格列酮早期干预能显著增加OLETF鼠肝脏及胰腺组织中IRS-1的表达水平，可能是其改善胰岛素抵抗的机制之一。3．OLETF鼠肝脏中IKKβ表达与NF-κB的阳性单位在各周龄时均呈高度正相关（P＜0.001）；与IRS-1阳性单位呈负相关，其中32周龄和40周龄时相关性有统计学意义（P＜0.02）。在胰腺组织中有同样的趋势。验证了IKK在炎症与胰岛素抵抗中的桥梁作用。4．罗格列酮通过降低胰岛素作用的靶器官中IKKβ的表达，达到改善胰岛素抵抗和抗炎作用，可能是其预防2型糖尿病发病的基本机制之一。

全文目录

中文摘要  3-12
英文摘要  12-20
前言  20-25
第一章罗格列酮对OLETF鼠胰岛素敏感器官—肝脏及胰腺的形态学影响  25-44
  第1节实验材料  25-27
  第2节实验方法  27-31
  第3节结果  31-39
  第4节讨论  39-44
第二章罗格列酮对OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影响  44-74
  第1节实验材料  44-47
  第2节实验方法  47-52
  第3节结果  52-69
  第4节讨论  69-74
小结  74-75
参考文献  75-82
英文缩略词表  82-83
综述  83-93
致谢  93-94

罗格列酮对OLETF鼠糖尿病发病机制中IKK/NF-κB通路作用的初步研究

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