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PEG胁迫下小麦甜菜碱含量的变化及类脱水素基因表达的分析

作　者: 马钰
导　师: 张林生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦水分胁迫甜菜碱脱水素 RT-HPLC
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

干旱是影响农业生产的重要因素。研究植物的抗旱机理,培育抗旱的优良品种成为提高农业产量,优化农产品质量的重要措施与方法。植物在干旱条件下,细胞内的生理生化发生很大的变化,会产生许多渗透调节物质,如脯氨酸、甜菜碱、渗调素等。甜菜碱(Betaine)是一类季胺类化合物,极易溶于水。许多高等植物受到胁迫时积累大量的甘氨酸甜菜碱,他们主要富集于细胞质中,作为一种无毒害的渗透调节剂维持细胞渗透压,稳定生物大分子和细胞膜结构,维持正常的生理功能,解除高浓度盐对酶活性的影响和保护呼吸酶、提高光合作用效率并参与能量代谢过程。本研究首先建立了该实验系统中的甜菜碱提取方法,即材料经去离子水提取,采用离子交换树脂分离纯化,采用正交法优化了水浴时间、浸提温度等各实验条件,并确定了液相色谱的流动相、柱温、检测波长等最佳色谱分离条件。用该方法测定不同水分胁迫处理下两种不同耐旱型小麦幼苗中甜菜碱含量的变化规律,探讨了甜菜碱与小麦耐旱性之间的关系,旨在进一步说明不同耐旱性作物体内甜菜碱含量与耐旱性的关系。本实验获得如下结果:(1)通过正交实验,得到提取甜菜碱的最佳条件是:水浴温度90℃,水浴时间60min,浸提温度4℃,加去离子水体积10mL,其中,水浴温度对甜菜碱的提取影响较大。(2)两种小麦幼苗在水分胁迫及复水过程中,甜菜碱含量均呈先增后减的变化,且变化趋势相似。抗旱型小麦陕合6#(S6)在正常水分条件下体内甜菜碱含量不高,但在水分胁迫时,迅速积累大量甜菜碱以满足作物耐旱的需要;而非耐旱型小麦郑引1#(Z1),正常状态下甜菜碱含量虽较高,但在缺水时,合成甜菜碱的量较少,时间上较晚。此外,Z1在水分胁迫最严重时期(48h),甜菜碱含量降到正常水平以下。耐旱性强的小麦幼苗在干旱胁迫下能在较短时间内迅速合成大量甜菜碱,可见甜菜碱的合成与小麦耐旱性有着重要的关系。由实验结果得出两种结论,(1)在小麦体内含水量达到某一水平时,甜菜碱合成酶基因活性最大,此时,植物体内合成甜菜碱的浓度最大,含水量偏低或偏低,甜菜碱合成酶基因活性均不活跃。(2)从植物处于干旱条件下开始,甜菜碱就持续被合成,但随干旱胁迫程度的加深,植物体内的生理机制由于抗旱的需要,对甜菜碱的消耗量增大。本研究根据已知脱水素基因的保守序列设计引物,利用干旱胁迫下小麦幼苗的RNA反转录得到cDNA第一链,再经RT-PCR扩增出双链全长序列。全长序列经双酶切处理后与质粒载体(PGEM-T easy)连接构建克隆载体,转化JM109,筛选阳性克隆并进行培养,提取阳性克隆菌株质粒,酶切电泳检测。由PCR后的电泳图片显示出,干旱胁迫条件下的小麦叶片中合成有487bp的脱水素基因,而正常供水条件下小麦叶片内无该基因合成,说明该基因是在水份胁迫条件下诱导表达,正常供水情况下不表达。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述  13-30
  1.1 植物抗旱机理研究进展  13-18
    1.1.1 干旱对植物伤害  13-14
    1.1.2 植物耐旱性的生物学机理  14-16
      1.1.2.1 气孔行为  14-15
      1.1.2.2 渗透调节  15
      1.1.2.3 抗氧化防御系统  15
      1.1.2.4 脱落酸作用  15-16
      1.1.2.5 Lea 蛋白的保护作用  16
      1.1.2.6 渗透蛋白与植物的抗旱性  16
    1.1.3 渗透调节物质与植物的抗旱性  16-18
      1.1.3.1 脯氨酸(Pro) 与植物的抗旱性  16-17
      1.1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD) 与植物的抗旱性  17
      1.1.3.3 脱落酸(ABA) 与植物的抗旱性  17-18
      1.1.3.4 甜菜碱与植物的抗旱性  18
  1.2 甜菜碱的研究进展  18-26
    1.2.1 甜菜碱的理化性质与分布  18
    1.2.2 甜菜碱的生物合成  18-19
    1.2.3 甜菜碱的诱导合成积累  19-20
    1.2.4 甜菜碱的生理功能  20-22
      1.2.4.1 甜菜碱诱导相容性溶质的生物合成  20-21
      1.2.4.2 甜菜碱参与细胞渗透调节作用  21
      1.2.4.3 甜菜碱参与稳定生物大分子的功能  21-22
      1.2.4.4 甜菜碱影响离子在细胞内的分布  22
      1.2.4.5 甜菜碱增加抗盐的持久性  22
    1.2.5 甜菜碱与植物抗逆性的关系  22-24
      1.2.5.1 甜菜碱与水分胁迫的关系  22-23
      1.2.5.2 甜菜碱与盐胁迫的关系  23
      1.2.5.3 甜菜碱与温度胁迫的关系  23-24
      1.2.5.4 甜菜碱与其它胁迫的关系  24
    1.2.6 外源甜菜碱对植物抗旱的研究  24-26
      1.2.6.1 外源甜菜碱对小麦发芽率，幼苗株高及硝酸还原酶含量的影响  24-25
      1.2.6.2 外源甜菜碱对光合作用的影响  25-26
  1.3 甜菜碱含量的测定方法  26-30
    1.3.1 光谱法  26-27
    1.3.2 薄层色谱扫描法  27
    1.3.3 高效液相色谱法  27-28
    1.3.4 酸碱滴定法  28
    1.3.5 重量法  28
    1.3.6 微型电极法  28
    1.3.7 毛细管电泳法  28-30
第二章PEG 胁迫下小麦甜菜碱含量的变化  30-40
  2.1 实验仪器与材料  30-31
    2.1.1 实验仪器与试剂  30-31
    2.1.2 实验材料  31
      2.1.2.1 材料培养  31
      2.1.2.2 样品采集  31
  2.2 实验方法  31-32
    2.2.1 色谱条件  31
    2.2.2 树脂的预处理  31-32
    2.2.3 分析样品的制备  32
  2.3 结果与分析  32-38
    2.3.1 液相色谱分离条件的优化  32-37
      2.3.1.1 提取条件的正交优化  32-33
      2.3.1.3 柱温的选择优化  33-34
      2.3.1.4 离子对试剂对分离效果的影响  34
      2.3.1.5 不同浓度的流动相(KH_2PO_4)对分离结果的影响  34-35
      2.3.1.6 标准曲线  35-36
      2.3.1.7 方法学考察  36
      2.3.1.8 不同胁迫处理小麦叶片中甜菜碱的分析  36-37
    2.3.2 干旱胁迫对小麦植株的影响  37
    2.3.3 干旱胁迫对小麦甜菜碱含量的影响  37-38
    2.3.4 甜菜碱对作物抗旱的影响  38
  2.4 结论  38-40
第三章水分胁迫下小麦类脱水素基因表达分析  40-50
  3.1 实验材料与试剂  40-42
    3.1.1 植物材料  40
    3.1.2 植物材料的处理与采集  40-41
    3.1.3 菌株及质粒  41
    3.1.4 主要试剂  41-42
      3.1.4.1 小麦总RNA 提取及反转录试剂  42
      3.1.4.2 聚合酶链式反应（PCR）、核酸电泳试剂  42
      3.1.4.3 目的基因鉴定、培养基及培养液  42
  3.2 实验方法  42-46
    3.2.1 总RNA 的提取  42-43
    3.2.2 cDNA 的合成  43-46
      3.2.2.1 RT-PCR 反转录合成第一链（参见TaKaRa PCR cDNA synthesis kit）  43
      3.2.2.2 PCR 扩增双链（参见TaKaRa PCR）  43-44
      3.2.2.3 PCR 产物回收  44
      3.2.2.4 回收产物与载体的连接  44
      3.2.2.5 感受态细胞JM109 的制备与转化  44-45
      3.2.2.6 菌落PCR 进行重组菌的筛选和鉴定  45-46
    3.2.3 构建表达载体  46
      3.2.3.1 提取质粒  46
      3.2.3.2 双酶切  46
  3.3 结果与分析  46-48
    3.3.1 总RNA 的提取  46-47
    3.3.2 cDNA 的合成  47-48
  3.4 结论  48-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
作者简介  57

PEG胁迫下小麦甜菜碱含量的变化及类脱水素基因表达的分析

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