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利用核移植技术生产转基因山羊有关问题研究

作　者: 赵禹
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 体细胞核移植 转基因动物 人溶菌酶基因 山羊
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术在生产转基因动物、制作动物乳腺生物反应器等方面被广泛应用。但体细胞核移植技术还有许多未解决的问题,生产效率低,技术环节还需要不断完善。本研究以山羊为实验动物,为提高转基因体细胞核移植山羊的成功率,进行了方案优化。研究结果如下:1.研究了接触抑制法、血清饥饿法处理普通山羊胎儿成纤维细胞(GFF)和转染人溶菌酶基因山羊胎儿成纤维细胞(hLYZ GFF)对核移植重构胚体外发育的影响。结果显示,核移植前使用接触抑制法、血清饥饿法处理转基因细胞和普通细胞为供体细胞对重构胚的卵裂率和囊胚发育率差异均不显著(P>0.05)。2.对比了以GFF和hLYZ GFF为供体细胞对重构胚体外发育的影响,结果显示以hLYZ GFF为供体细胞构建的重构胚的卵裂率和囊胚发育率都低于GFF组,但差异不显著(P>0.05)。3.探讨了75 nmol/L的曲古抑菌素A(TSA)处理hLYZ GFF 0h、6h、12h、24h对重构胚体外发育能力的影响。结果显示,75 nmol/L的TSA处理hLYZ GFF12 h可以一定程度上提高重构胚的囊胚发育率,但与未用TSA处理组相比差异不显著(P>0.05)。4.优化了转基因核移植电融合参数。比较了26V、28V、30V和34V电压对融合效率和胚胎发育的影响。结果显示,各组的融合率差异不显著(P>0.05),在30V和34V条件下,重构胚的激活卵裂率显著高于26V和28V组(P<0.05)。表明30V和34V更适合转基因核移植融合电压。5.比较了体外发育的2-细胞重构胚移植和囊胚移植对妊娠率的影响。结果显示,2-细胞胚胎移植妊娠率为16.7%,而囊胚移植未见妊娠。表明,移植2-细胞转基因克隆胚胎妊娠率高,比体外培养到囊胚阶段的胚胎优越。6.比较了在核移植过程不同阶段添加细胞松弛素B(CB)对重构胚体外发育的影响。表明在融合液中添加CB对融合率及重构胚后期发育率无影响;在重构胚激活前添加CB处理1 h的重构胚的体外囊胚发育率显著高于未添加CB组(P<0.05),并且处理后2-细胞阶段胚胎移植后妊娠率高于不处理组(38.5% vs 16.7%)。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
文献综述  9-19
  第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展  9-15
    1.1 体细胞核移植技术的历史  9
    1.2 体细胞核移植方法的发展  9-10
    1.3 体细胞核移植相关理论的发展  10-12
      1.3.1 DNA 甲基化  10-11
      1.3.2 组蛋白乙酰化  11
      1.3.3 基因组印记  11
      1.3.4 X 染色体失活  11-12
    1.4 提高体细胞核移植成功率的可能措施  12-15
      1.4.1 优化核移植的操作程序  12-13
      1.4.2 供体细胞和受体胞质的准备和处理  13-15
  第二章 转基因动物研究进展  15-19
    2.1 转基因动物生产方法研究概况  15-18
      2.1.1 显微注射法  15
      2.1.2 逆转录病毒感染法  15-16
      2.1.3 胚胎干细胞法  16
      2.1.4 精子载体法  16-17
      2.1.5 体细胞核移植法  17
      2.1.6 性腺转基因方法  17-18
    2.2 转基因动物的应用前景  18
      2.2.1 构建动物生物反应器  18
      2.2.2 异种器官移植  18
    2.3 转基因动物技术存在的问题  18-19
试验研究  19-37
  第三章 供体细胞的处理对核移植效率的影响  19-27
    3.1 材料和方法  20-22
      3.1.1 实验材料与试剂  20
      3.1.2 供体细胞的准备和处理  20-21
      3.1.3 细胞周期分析  21
      3.1.4 山羊卵母细胞的采集及体外成熟培养  21
      3.1.5 重构胚的构建与激活培养  21-22
      3.1.6 试验设计  22
      3.1.7 数据分析  22
    3.2 结果与分析  22-25
      3.2.1 接触抑制和血清饥饿处理供体细胞的细胞周期检测  22-23
      3.2.2 接触抑制和血清饥饿处理供体细胞对核移植效率效果的比较  23
      3.2.3 供体细胞经TSA 处理对山羊转基因克隆胚胎发育能力的影响  23-25
    3.3 讨论  25-27
  第四章 生产转基因体细胞核移植山羊实验条件的优化  27-37
    4.1 材料和方法  27-30
      4.1.1 试剂与实验动物  27
      4.1.2 卵母细胞的体外成熟  27-28
      4.1.3 供体细胞的准备  28
      4.1.4 MⅡ期卵母细胞的去核  28
      4.1.5 核移植  28
      4.1.6 重构胚的激活与培养  28
      4.1.7 胚胎移植与妊娠诊断  28-29
      4.1.8 试验设计  29
      4.1.9 数据分析  29-30
    4.2 结果与分析  30-33
      4.2.1 不同的电融合参数对核移植效率的影响  30
      4.2.2 2-细胞移植和囊胚移植对受体妊娠率的影响  30-31
      4.2.3 融合液中添加CB 与否对核移植效率的影响  31-32
      4.2.4 核移植重构胚激活前CB 处理对重构胚体外发育的影响  32
      4.2.5 核移植重构胚激活前CB 处理与否对妊娠率的影响  32-33
    4.3 讨论  33-37
      4.3.1 电融合参数  33-34
      4.3.2 2-细胞移植和囊胚移植  34-35
      4.3.3 CB 处理  35-37
结论  37-38
参考文献  38-48
附录一  48-49
附录二  49-50
附录三  50-51
致谢  51-52
作者简介  52

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 细胞工程
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