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反向重复TuMV HC-Pro基因转化植物的研究

作　者: 高乃波
导　师: 施曼玲
学　校: 杭州师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 芜菁花叶病毒 HC-Pro基因 反向重复 dsRNA 基因转化 抗病性
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究将反向重复的芜菁花叶病毒(TuMV)HC-Pro基因定向插入到植物表达载体pCambia1301上35S启动子下游,并以农杆菌介导的叶盘法转化烟草、拟南芥和雪菜,获得转基因植物。并对转基因烟草的抗病性进行研究。根据已经发表的TuMV HC-Pro基因序列,设计特异性引物。通过PCR扩增获得部分正反向的HC-Pro基因片段。正向的HC-Pro基因与pGEM-T载体相连,经Xba I, Kpn I双酶切,所得基因片段插到同样酶切开的载体pCambia1301上;反向的HC-Pro基因连入pMD18-T载体,再用Xba I, Pst I双酶切切下,连接到已经插入正向的HC-Pro基因的pCambia1301载体上。鉴定筛选得到含TuMV HC-Pro基因的反向重复植物表达载体pCambia1301-TuMV HC-Pro。三亲交配法将植物表达载体pCambia1301-TuMV HC-Pro转入根癌农杆菌EHA105菌株,得到的阳性转化子用于植物转化。用农杆菌介导的叶盘法,将反向重复TuMV HC-Pro基因转入烟草,潮霉素抗性筛选获得转基因植株,PCR检测阳性率为93.33 %。对部分烟草植株进行Southern印迹杂交和RT-PCR,结果表明TuMV HC-Pro已整合到烟草基因组。接种60株转基因烟草植株,症状观察和ELISA检测表明,转基因烟草对TuMV表现出四种不同的抗病性类型:(1)免疫型,整个植物在生长过程中无病症,ELISA反应阴性,接种后前五周生长缓慢,节间变短,第六周开始正常生长。(2)抗病型,植物接种后第三周开始发病,第五周病症最严重,第七周开始新生的叶子不发病;节间极度变短。(3)延迟发病型,比非转基因植株延迟一周发病,病症类似。(4)感病型,与非转基因植株一样接种后第三周开始发病,两者病症相似。60株转基因植株中免疫型共2株,占3.33%;抗病型共3株,占5%;延迟发病型,共13株,占21.67%;感病型共42株,占70%。用滴花法和抽真空法将反向重复TuMV HC-Pro基因转入拟南芥,两种方法的平均转化率分别为1.15 %和0.48 %。潮霉素抗性筛选,共获得30株转基因植株。基因组PCR以及RT-PCR检测表明TuMV HC-Pro已整合到拟南芥基因组,并获得表达。以雪里蕻(Brassica juncea Coss. var. multiceps Tsen et Lee)子叶、带柄子叶、子叶柄和下胚轴为外植体,在添加不同植物生长调节剂的MS培养基上进行分化培养。结果表明:在4种外植体中,带柄子叶不定芽分化能力最强。子叶和带柄子叶不定芽分化的最适培养基分别为MS + 2 mg/L 6-BA + 0. 4 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3和MS + 2 mg/L 6-BA +0. 2 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3。带柄子叶和子叶不定芽分化的最佳苗龄都为5 d。AgNO3能显著地促进带柄子叶不定芽的分化,以5 mg/L的浓度为最佳。不同基因型对带柄子叶不定芽分化影响不大,但对子叶影响较明显。不定根诱导的最佳培养基为MS+0.2 mg/L NAA。用农杆菌介导的叶盘法,将反向重复TuMV HC-Pro基因转化雪里蕻,初步构建雪里蕻的遗传转化体系。本论文研究了外植体类型、农杆菌侵染浓度和时间,预培养、共培养和预筛选时间,以及筛选和抑菌抗生素的浓度等对雪里蕻转化效率的影响。结果表明:5 d苗龄的带柄子叶,15 min农杆菌侵染时间,OD600值0.6的侵染浓度,3 d的共培养和预筛选时间,15 mg/L Hyg筛选浓度,400 mg/L Car的抑菌浓度,添加活性碳以及150μg/L AS等条件可提高雪里蕻转化频率。PCR检测,只有1株抗性植株能扩增出500bp大小的条带,与预期转入的HC-Pro基因大小相吻合。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章 RNA 沉默及其应用的研究进展  10-19
  1 引言  10
  2 RNA 沉默的分类  10-13
    2.1 转录水平的基因沉默(TGS)  11
    2.2 转录后的基因沉默(PTGS)  11-13
  3 RNA 沉默机制  13-15
  4 RNA 沉默的信号  15-16
    4.1 可能的信号分子  15
    4.2 信号分子传导的特点  15-16
  5 RNA 沉默的病毒抑制子  16-18
    5.1 植物病毒抑制子干扰基因沉默的机制  16
    5.2 植物病毒抑制子的分类  16-17
    5.3 病毒抑制子的鉴定方法  17
    5.4 病毒抑制子需要解决的问题  17-18
  6 RNA 沉默的应用展望  18-19
第二章 TuMV HC-Pro 基因反向重复植物表达载体的构建  19-27
  1 材料  19
    1.1 质粒与菌种  19
    1.2 酶与化学试剂  19
    1.3 抗生素  19
  2 方法  19-24
    2.1 植物表达载体的构建策略  19-20
    2.2 目的基因的扩增  20-22
    2.3 HC-Pro 基因反向重复植物表达载体的构建  22-24
    2.4 三亲交配法将 pCambia1301-TuMV HC-Pro 导入农杆菌 EHA105  24
  3 结果与讨论  24-27
    3.1 HC-Pro 基因的克隆和反向重复植物表达载体的构建  24-27
第三章 反向重复 TuMV HC-Pro 基因转化烟草的研究  27-43
  1 材料  27-28
    1.1 植物材料  27
    1.2 菌株  27
    1.3 培养基与抗生素  27-28
    1.4 抗血清与毒源  28
  2 方法  28-32
    2.1 反向重复 HC-Pro 基因转化烟草  28-29
    2.2 转基因烟草植株对 TuMV 的抗性分析  29
    2.3 转基因烟草的分子生物学检测  29-32
  3 结果与分析  32-41
    3.1 烟草再生体系 Hyg 筛选压的确定  32-33
    3.2 烟草再生体系 Kan 筛选压的确定  33
    3.3 转基因烟草植株的获得  33-34
    3.4 转基因烟草植株对 TuMV 的抗性分析  34-38
    3.5 转基因烟草植株的分子生物学检测  38-41
  4 讨论  41-43
第四章 反向重复 TuMV HC-Pro 基因转化拟南芥的研究  43-49
  1 材料  43
    1.1 植物材料  43
    1.2 质粒和菌株  43
  2 方法  43-44
    2.1 拟南芥的播种  43
    2.2 拟南芥的转化  43-44
    2.3 转基因拟南芥 Hyg 筛选压的确定  44
    2.4 转基因拟南芥植株的 PCR 检测  44
    2.5 转基因拟南芥植株的 RT-PCR 检测  44
  3 结果与分析  44-48
    3.1 拟南芥 Hyg 筛选压的确定  44-47
    3.2 转基因拟南芥的分子生物学检测  47-48
  4 讨论  48-49
第五章 雪里蕻高效再生体系的构建  49-56
  1 材料  49
    1.1 植物材料  49
    1.2 培养基  49
  2 方法  49-50
    2.1 无菌苗的获得  49
    2.2 不定芽的诱导  49-50
    2.3 不定根的诱导  50
    2.4 组培苗的移栽  50
  3 结果与分析  50-54
    3.1 不定芽的诱导  50-53
    3.2 不定根的诱导  53-54
  4 讨论  54-56
第六章 反向重复 TuMV HC-Pro 基因转化雪里蕻的研究  56-69
  1 材料  56
    1.1 植物材料  56
    1.2 菌株  56
    1.3 培养基与抗生素  56
  2 方法  56-58
    2.1 雪里蕻的组织培养  56-57
    2.2 外植体 Hyg 筛选压的确定  57
    2.3 雪里蕻外植体的遗传转化  57
    2.4 抑制褐化实验  57-58
    2.5 乙酰丁香酮(AS)浓度的确定  58
    2.6 转基因雪里蕻植株的 PCR 检测  58
  3 结果与分析  58-67
    3.1 不同植物生长调节剂配比对不定芽分化的影响  58
    3.2 外植体预培养天数的确定  58-59
    3.3 外植体 Hyg 筛选压的确定  59-61
    3.4 菌液浓度和 Car 浓度的确定  61-62
    3.5 农杆菌侵染时间的确定  62-63
    3.6 暗培养时间的确定  63-64
    3.7 预筛选时间的确定  64
    3.8 抑制褐化实验  64-65
    3.9 乙酰丁香酮(AS)浓度的确定  65-66
    3.10 转基因雪里蕻植株的获得  66
    3.11 转基因雪里蕻植株的 PCR 检测  66-67
  4 讨论  67-69
参考文献  69-77
附录  77-91
致谢  91

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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