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运动发酵单胞菌发酵条件优化及其PDC基因的原核表达

作　者: 张炳照
导　师: 杨谦
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 运动发酵单胞菌 乙醇发酵 pdc基因 原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 27次
引　用: 1次
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内容摘要


随着化石能源的逐渐枯竭,燃料乙醇作为可替代能源的研究和发展在世界范围内受到越来越多的重视。构建能够高效发酵糖类生产乙醇的工程菌株是当前燃料乙醇生产研究的一项重要内容。本研究首先对运动发酵单胞菌乙醇发酵条件和培养基成分分别进行单因子优化和正交优化;其后采用该菌基因组为模板,克隆乙醇发酵关键酶基因pdc,以诱导型表达质粒pET-28a为载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21,初步优化诱导表达条件,最后,应用重组大肠杆菌进行乙醇发酵试验,研究该基因的表达对宿主菌体的葡萄糖代谢途径及乙醇发酵能力的影响。经过优化后确定运动发酵单胞菌Z-1培养基最佳葡萄糖含量为10%~15%,最适接种量为发酵培养基体积的1/50,最佳发酵温度为30℃~35℃,培养基最适pH为8.0~9.0;其发酵培养基最佳基础成分为:MgSO4:0.01%,(NH4)2SO4:0.18%,KH2PO4:0.18%,Yeastextract:0.9%;在这四种成分中,Yeastextract对乙醇产率的影响最大。本研究成功构建重组质粒pET-28a-pdc,实现了该基因在大肠杆菌中的表达,重组大肠杆菌发酵液中乙醇终浓度达到2.0mL/L。本论文中运动发酵单胞菌Z-1乙醇发酵条件与培养基成分的优化以及乙醇发酵关键酶基因在大肠杆菌中的成功表达为燃料乙醇生产提供了理论依据。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章 绪论  8-19
  1.1 研究背景  8-9
  1.2 国内外研究现状  9-18
    1.2.1 纤维素类物质转化生产燃料乙醇  9-12
    1.2.2 乙醇发酵型细菌研究进展  12-18
  1.3 课题来源及主要研究内容  18-19
    1.3.1 课题来源  18
    1.3.2 主要研究内容及意义  18-19
第2章 材料与方法  19-32
  2.1 实验材料  19-22
    2.1.1 菌株和质粒  19
    2.1.2 培养基  19
    2.1.3 酶与试剂  19
    2.1.4 实验药品  19-20
    2.1.5 主要仪器  20
    2.1.6 常用试剂和缓冲液  20-22
    2.1.7 引物设计及相关软件  22
  2.2 实验方法  22-32
    2.2.1 发酵液乙醇浓度的测定  22-23
    2.2.2 运动发酵单胞菌Z-1 乙醇发酵曲线的绘制  23
    2.2.3 运动发酵单胞菌Z-1 发酵条件单因子优化  23-24
    2.2.4 发酵培养基基础成分正交优化实验设计  24-25
    2.2.5 乙醇发酵关键酶基因pdc 的原核表达载体的构建  25-29
    2.2.6 重组质粒pET-28a-pdc 的诱导表达  29-30
    2.2.7 重组质粒pET-28a-pdc 的诱导条件优化  30
    2.2.8 重组大肠杆菌的乙醇发酵试验  30-32
第3章 运动发酵单胞菌发酵条件的优化  32-44
  3.1 重铬酸钾法测定乙醇浓度标准曲线的绘制  32-33
  3.2 运动发酵单胞菌Z-1 的乙醇发酵曲线的绘制  33-34
  3.3 运动发酵单胞菌发酵条件单因子实验  34-41
    3.3.1 发酵培养基含糖量对乙醇发酵的影响  34-37
    3.3.2 种子培养物接种量对乙醇发酵的影响  37-38
    3.3.3 发酵温度对乙醇发酵的影响  38-39
    3.3.4 发酵液pH 值对乙醇发酵的影响  39-41
  3.4 RM 培养基基础成分的发酵正交优化实验  41-43
  3.5 本章小结  43-44
第4章 乙醇发酵关键酶基因的原核表达  44-53
  4.1 原核表达质粒pET-28a-pdc 的构建  44-48
    4.1.1 运动发酵单胞菌基因组的提取及目的片段的克隆  44-45
    4.1.2 目的片段pdc 基因和表达质粒pET-28a 的双酶切及产物连接  45-46
    4.1.3 重组质粒pET-28a-pdc 的转化  46-48
  4.2 重组质粒pET-28a-pdc 在大肠杆菌中的诱导表达及优化  48-51
    4.2.1 重组质粒pET-28a-pdc 在BL21 中的诱导表达  48-49
    4.2.2 重组质粒pET-28a-pdc 在BL21 中的诱导表达条件优化  49-51
  4.3 重组质粒表达菌株BL21-pET-28a-pdc 乙醇发酵试验  51-52
  4.4 本章小结  52-53
结论  53-54
参考文献  54-58
附录1 运动发酵单胞菌pdc 基因编码区序列  58-59
附录2 重组质粒pET-28a-pdc 中pdc 基因测序峰图  59-61
攻读硕士学位期间发表的学术论文  61-63
致谢  63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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