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高效毛细管电泳法在细胞内整体DNA甲基化水平和氨甲蝶呤多聚谷氨酸链检测中的应用

作　者: 李明
导　师: 沈佐君
学　校: 安徽医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 高效毛细管电泳 DNA甲基化 5-甲基-2脱氧胞嘧啶氨甲蝶呤毛细管电泳法柱上样本堆积氨甲蝶呤多聚谷氨酸链
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis,HPCE),是20世纪80年代在全世界范围内迅速发展起来的一种新型分离分析技术,被认为是上世纪末分离分析领域最有影响力的分支之一,也是该领域的公认前沿。高效毛细管电泳具有分离效率高、分析速度快、费用低、所需样品少、易于操作、自动化程度高、应用范围广等优点,在生命科学、生物技术、临床医学、药学分析和环境科学等领域显示了极其重要的应用前景。本文报道了高效毛细管电泳在细胞内整体DNA甲基化水平和药物(氨甲蝶呤)及其代谢产物含量测定方面的应用。建立了分析整体DNA甲基化水平新的检测方法,为大规模临床样本检测和肿瘤患者的筛查提供了技术平台。同时,采用柱上样本堆积技术,克服了毛细管电泳灵敏度较低的缺点,成功的进行了细胞内氨甲蝶呤及其代谢产物含量测定,为氨甲蝶呤临床用药和治疗效果判断提供指导,也为临床微量或超微量样本的检测提供新的思路。第一部分高效毛细管电泳法检测整体DNA甲基化水平方法的建立及其在氨甲蝶呤耐药细胞内的应用目的建立一种简便快速检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法,以用于临床甲基化诊断。探讨氨甲蝶呤获得性耐药与整体DNA甲基化的相关性。方法采用高效毛细管电泳技术,以pH 9.6的48 mmol/L的碳酸氢钠溶液[含60 mmol/L十二烷基磺酸钠(SDS)]为分离缓冲液,检测波长为256 nm,在20 kV电压下,0.7 psi压力进样时间5 s,对2′-脱氧胞苷(dC)、5-甲基-2′-脱氧胞苷(mdC)、2′-脱氧腺苷(dA)、2′-脱氧胸苷(dT)、2′-脱氧鸟苷(dG)5种物质进行分离。在此基础上检测氨甲蝶呤(MTX)诱导的肺癌A549耐药细胞株内整体DNA甲基化水平。结果通过不断优化分离缓冲液中SDS浓度(40、60、80 mmol/L)、pH值(9.4、9.6、9.8)、分离电压(15、17、19、20、22 kV)、进样时间(5、10、15、20、30 s)和毛细管温度(15、20、25、30℃),建立高效毛细管电泳检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法,可在10 min内实现dC、mdC、dA、dT、dG的完全分离,其日内变异系数(CV)＜0.2%,日间CV＜2%,最低检出线为2μmol/L。肺癌A549亲本细胞甲基化水平为(4.80±0.52)%;不同浓度(15μmol/L、30μmol/L、40μmol/L)MTX诱导耐药A549细胞株的甲基化水平分别为:(4.20±0.44)%、(3.70±0.36)%、(3.10±0.35)%。结论建立高效毛细管电泳检测整体DNA甲基化水平的方法具有高效、快速、简单、灵敏的特点;MTX耐药细胞株内整体DNA甲基化水平随着耐药浓度的增加明显降低。第二部分柱上样本堆积毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤及其代谢产物目的建立柱上堆积高效毛细管电泳法同时检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG的方法。方法以PH 7.4 75 mmol/L的磷酸盐缓冲液作为分离介质,用水和乙腈(1:1)作溶剂重组残留样品的的方法进行柱上样本堆积,0.5 psi压力进样时间50 s,在分离电压28 KV,检测波长300 nm条件下对MTX和MTXPG进行分离。在此基础上,以非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,将处于对数生长期的细胞在终浓度为50μmol/L MTX孵育24小时,检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG的含量。结果通过不断改变分离缓冲液中异丙醇(5%、8%、10%,V/V)和hp-β-CD浓度(20、25、30 mmol/L),发现在含8%的异丙醇、25 mmol/L hp-β-CD的缓冲液条件下,30min内实现7种组分的完全分离。用水和乙腈(1:1)作溶剂重组残留样品的的方法进行柱上样本堆积的方法可实现检测灵敏度提高10倍。结论建立柱上样本堆积高效毛细管电泳法可同时检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG。该方法具有高效、快速、简单、超高灵敏度的特点。总结总之,高效毛细管电泳技术可以用于细胞内整体DNA甲基化和微量药物及其代谢产物含量测定,毛细管电泳具有分离能力高、分离时间短、运行成本低且样品消耗少等许多优势。它在化学和生物化学分析领域具有很大的潜力,尤其在生物化学分析中,作为一种新兴、快速有效的分析方法将会得到快速发展。但是毛细管电泳也有其不足。我们在实验中发现石英管内表面和带高电荷的物质间的吸附是电泳过程中的主要问题,其直接影响到实验分离的效率和实验的重复性。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
正文  14-47
  第一部分高效毛细管电泳法检测整体DNA甲基化水平方法的建立及其在氨甲蝶呤耐药细胞内应用  14-32
    1 前言  14-16
    2 实验原理  16-17
    3 材料和方法  17-20
    4 结果  20-26
    5 讨论  26-28
    6 结论  28-29
    7 参考文献  29-32
  第二部分柱上样本堆积毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤及其代谢产物  32-47
    1 前言  32-33
    2 实验原理  33-34
    3 材料和方法  34-37
    4 结果  37-42
    5 讨论  42-44
    6 结论  44-45
    7 参考文献  45-47
个人简介  47-48
致谢  48-49
综述及参考文献  49-56

高效毛细管电泳法在细胞内整体DNA甲基化水平和氨甲蝶呤多聚谷氨酸链检测中的应用

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