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稳恒磁场与抗肿瘤药物联合作用对肿瘤细胞杀伤效应的研究

作　者: 徐玲玲
导　师: 齐浩
学　校: 陕西师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 稳恒磁场抗肿瘤药物协同杀伤效应 MTT 单细胞凝胶电泳原子力显微镜透射电镜
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

目的：研究不同种类抗肿瘤药物联合稳恒磁场对贴壁生长的鼠肝癌Hepa1-6细胞的协同杀伤作用,并进一步探究比较其细胞学机制。方法：1.采用MTT法检测磁场、药物及磁场+药物对贴壁生长的Hepal-6细胞(鼠肝癌细胞)增殖的影响。2.通过单细胞凝胶电泳、流式细胞仪手段,检测稳恒磁场联合不同种类的抗肿瘤药物对细胞周期分布和细胞DNA损伤的影响。3.用光学显微镜、原子力显微镜、透射电镜等手段,检测不同种类抗肿瘤药物结合稳恒磁场对Hepal-6细胞的结构影响。结果：1.(1)Hepal-6细胞经9mT稳恒磁场处理后,MTT检测结果表明,36h的磁场处理可对Hepa1-6细胞生长造成极显著的抑制效应(p<0.01)。(2)Hepa1-6细胞用环磷酰胺连续作用细胞12小时后,药物浓度高达5mg／mL时也没有检测到其对细胞的杀伤作用。药物连续作用24h需要3mg／mL的环磷酰胺才具有显著杀伤效应(p<0.05)。(3)Hepal-6细胞经10μg/mL顺铂单独处理细胞12h即可引起细胞生长抑制(p<0.05)；24h处理需要的顺铂浓度为1μg／mL,细胞产生明显的生长抑制(p<0.05)。(4)Hepal-6细胞经100ng／mL阿霉素单独处理细胞12h即造成细胞生长抑制(p<0.05)；24h仅需20ng／mL阿霉素即可达到同样效果。(5)Hepal-6细胞经1μg／mL喜树碱处理细胞12h发生细胞生长抑制(p<0.05)。(6)10μg／mL紫杉醇单独处理Hepal-6细胞12h即可引起其生长抑制(p<0.05)；24h紫杉醇处理仅需50ng／mL即可检测出细胞生长明显抑制(p<0.05)。2. (1)Hepal-6细胞在2.5mg/mL环磷酰胺单独处理24h时未检出杀伤效应(p<0.05)；但与磁场联合作用时,可对细胞产生极明显的杀伤效应(p<0.01)。(2)Hepal-6细胞在1μg／mL顺铂与磁场联合作用24h时,产生的杀伤效应显著高于单纯顺铂作用(p<0.01)。(3)Hepal-6细胞在20ng／mL阿霉素和磁场联合作用下产生的杀伤作用也显著高于阿霉素的单独作用(p<0.05)。(4)Hepal-6细胞在200ng／mL喜树碱与磁场联合作用24h时产生的杀伤效应极显著的高于单纯喜树碱(p<0.01)。(5)Hepal-6细胞在50ng／mL紫杉醇与磁场联合作用24h后,可产生比紫杉醇单独处理更为明显的细胞生长抑制(p<0.01)。3.(1)环磷酰胺使G2/M期细胞略有增加而S期细胞比例减少,但是环磷酰胺联合磁场后S期细胞比例减少而G2/M期细胞比例明显增多,显示磁场增强了环磷酰胺对细胞的效应。彗星检测的结果显示：磁场未对细胞DNA造成损伤,而环磷酰胺则对DNA造成明显损伤。磁场与药物的联合作用没有使损伤增加。(2)顺铂可减少G1与G2／M期细胞比例,而明显增加S期细胞比例。磁场与顺铂联合使用后G1期细胞比例进一步下降而G2／M期细胞的比例明显增加,数据显示磁场在某种程度上改变了顺铂对细胞周期分布的影响。彗星检测发现磁场极大地增加了顺铂对细胞DNA的损伤。(3)阿霉素可使G2／M期细胞略有增加,磁场与阿霉素联合作用后细胞主要停留于G1和G2／M期,S期细胞比例降到最低。彗星检测发现,磁场也极大增强了阿霉素对细胞DNA的损伤作用。(4)紫杉醇作用后细胞主要被阻断在G2／M期,磁场与紫杉醇联合作用后,后者对细胞周期的影响未被磁场改变。彗星电泳检测数据显示,磁场可协同紫杉醇增强对细胞DNA的损伤。(5)喜树碱单独或与磁场联合作用细胞后,彗星电泳检测数据表明,未发现细胞DNA损伤,表明喜树碱以及喜树碱与磁场联合处理对Hepa1-6细胞的生长抑制作用不涉及DNA损伤。4.形态学研究显示(1)光学显微镜下观察到磁场处理细胞后细胞形态几无改变,但不同种类的抗肿瘤药物分别处理后细胞膜完整性破坏,胞浆明显空泡化。磁场与药物联合作用可使Hepa1-6细胞的损伤加剧,胞浆出现多个大的空泡,甚至细胞膜崩解,细胞内容物释放。(2)AFM可观察到环磷酰胺能在细胞表面形成凹陷,磁场与环磷酰胺共处理后细胞表面凹陷增多；而透射电镜未观测到明显变化。(3)顺铂作用后AFM可见细胞表面出现尺度不同的凹陷,与磁场共处理后,细胞表面的凹陷增大变深。(4)AFM观察到阿霉素可在细胞表面产生突起和许多小的凹陷,磁场与阿霉素共处理使细胞表面粗糙度增加,出现更大的凹陷样结构；透射电镜也能观察到AFM显示的细胞表面的凹陷。(5)喜树碱作用后AFM观察细胞表面发现孔洞样结构,磁场可使喜树碱影响细胞表面,使其产生较为集中的凹陷,且其邻近部位有散在的突起。透射电镜观察该孔洞样结构是磁场和喜树碱共同作用下细胞表面生成的多个凹陷。(6)AFM观察紫杉醇处理的细胞发现细胞表面略呈粗糙,并出现大小不等的凹陷,磁场与紫杉醇联合作用后细胞表面的凹陷和孔洞样结构略有增加,且出现较大和较深的凹陷。透射电镜观察紫杉醇作用后细胞膜未产生明显改变,但联合磁场时,对细胞膜有明显损伤,细胞表面除有较多凹陷产生外,可见微绒毛排列混乱。结论：1)不同的抗肿瘤药物(环磷酰胺、顺铂、阿霉素、喜树碱和紫杉醇)联合稳恒磁场在一定条件下对Hepa1-6细胞皆有协同杀伤效应。2)通过对细胞周期分布、细胞DNA损伤及细胞形态的检测发现：不同抗肿瘤药物联合稳恒磁场对Hepa1-6细胞的协同杀伤可能与磁场对细胞膜的影响有关,磁场可能增加细胞对药物的敏感性。另外,磁场也可通过增强某些药物对细胞DNA的损伤来增强肿瘤药物的抗癌效应。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第1章文献综述  10-17
  1.1 磁场的细胞生物学效应  10-12
    1.1.1 磁场对细胞增殖及代谢的影响  11
    1.1.2 磁场对细胞形态及内部结构的影响  11
    1.1.3 磁场对细胞DNA损伤的影响  11
    1.1.4 磁场对细胞周期的影响  11-12
  1.2 抗肿瘤药物概述  12-14
    1.2.1 抗肿瘤药物分类  12-13
    1.2.2 抗肿瘤药物作用机理  13-14
  1.3 磁场结合抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤  14-16
    1.3.1 磁场联合抗肿瘤药物对肿瘤细胞生长活性的影响  15
    1.3.2 磁场联合抗肿瘤药物对细胞膜的影响  15
    1.3.3 磁场联合抗肿瘤药物对细胞周期的影响  15-16
  1.4 本文的主要研究工作  16-17
第2章磁场或不同种类抗肿瘤药物对Hepa1-6细胞增殖的影响  17-30
  2.1 材料和方法  18-20
    2.1.1 主要实验仪器和试剂  18-19
    2.1.2 细胞培养  19
    2.1.3 MTT检测  19
    2.1.4 HPeal-6细胞密度依赖实验  19
    2.1.5 磁场处理系统  19-20
    2.1.6 曝磁实验  20
    2.1.7 抗肿瘤药物对Hepa1-6细胞杀伤浓度的筛选  20
    2.1.8 数据分析  20
  2.2 实验结果  20-27
    2.2.1 密度依赖实验  20-21
    2.2.2 稳恒磁场对Hepa1-6细胞杀伤参数的筛选  21-22
    2.2.3 不同种类抗肿瘤药物对Hepa1-6细胞杀伤浓度筛选  22-27
  2.3 讨论  27-29
  2.4 结论  29-30
第3章稳恒磁场结合不同抗肿瘤药物对Hepa1-6细胞增殖的影响  30-37
  3.1 材料与方法  30-31
    3.1.1 主要实验仪器和试剂  30
    3.1.2 细胞培养、MTT检测方法以及磁场发生装置见第二章  30
    3.1.3 抗肿瘤药物联合稳恒磁场对肿瘤细胞杀伤效应的实验设计  30-31
    3.1.4 数据分析  31
  3.2 结果  31-35
    3.2.1 环磷酰胺联合稳恒磁场对Hepa1-6细胞杀伤参数的筛选  31-32
    3.2.2 顺铂联合稳恒磁场对Hepa1-6细胞杀伤参数的筛选  32
    3.2.3 阿霉素联合稳恒磁场对Hepa1-6细胞杀伤参数的筛选  32-34
    3.2.4 喜树碱联合稳恒磁场对Hepa1-6细胞杀伤参数的筛选  34
    3.2.5 紫杉醇与稳恒磁场联合作用对Hepa1-6细胞杀伤参数的筛选  34-35
  3.3 讨论  35-36
  3.4 结论  36-37
第4章不同种类抗肿瘤药物结合稳恒磁场对Hepa1-6细胞DNA损伤的影响  37-54
  4.1 材料与方法  37-41
    4.1.1 主要实验仪器和试剂  37-39
    4.1.2 细胞培养及磁场处理系统(见第二章1.2)  39
    4.1.3 磁场结合不同抗肿瘤药物处理细胞的实验分组(处理条件见第三章的参数筛选)  39-40
    4.1.4 流式细胞仪(FCM)样品制备及分析  40
    4.1.5 单细胞凝胶电泳(SCGE)实验流程  40-41
    4.1.6 数据分析  41
  4.2 实验结果  41-50
  4.3 讨论  50-52
  4.4 结论  52-54
第5章不同种类抗肿瘤药物结合稳恒磁场对Hepa1-6细胞结构影响的研究  54-66
  5.1 材料与方法  54-56
    5.1.1 主要实验仪器和试剂  54-55
    5.1.2 细胞培养及磁场处理系统(见第二章1.2)  55
    5.1.3 磁场结合不同抗肿瘤药物处理细胞的实验分组(见第四章1.3)  55
    5.1.4 HE染色流程  55-56
    5.1.5 原子力显微镜观测  56
    5.1.6 透射电镜样品制备及分析  56
  5.2 实验结果  56-63
    5.2.1 不同抗肿瘤药物分别联合磁场处理后Hepa1-6细胞形态的观察  56-58
    5.2.2 不同抗肿瘤药物分别联合磁场处理Hepa1-6细胞后原子力显微镜(AFM)的观察结果  58-61
    5.2.3 不同抗肿瘤药物分别联合磁场处理后Hepa1-6细胞后透射电镜的检测结果  61-63
  5.3 讨论  63-65
  5.4 结论  65-66
总结  66-68
参考文献  68-75
致谢  75-76
攻读学位期间研究成果  76-77

稳恒磁场与抗肿瘤药物联合作用对肿瘤细胞杀伤效应的研究

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