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单细胞凝胶电泳作为辐射生物剂量计的研究

作　者: 杨永华
导　师: 姜恩海；刘强；江波
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 放射医学
关键词: 单细胞凝胶电泳 DNA损伤辐射生物剂量学放射工作人员
分类号: R144
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE),又称彗星试验(comet assay),是近年来由Ostling等建立,经Singh等改进的用于检测有核细胞DNA损伤的技术,可在单个细胞水平上检测DNA损伤和修复。有研究文献报道,对于放射性工作人员DNA损伤的评价,SCGE的结果与染色体畸变、微核试验的结果基本一致,而SCGE的敏感性更高,速度更快。本研究的目的是采用中性单细胞凝胶电泳技术：①检测DNA辐射损伤的剂量-效应关系,从而拟合剂量-效应曲线；②检测辐射诱导的DNA双链断裂时效性研究,拟合修复曲线；③放射工作人员的DNA损伤情况,探讨不同工种、工龄、吸烟、性别等对DNA损伤的影响,探讨中性SCGE作为放射工作人员健康查体的指标；④探讨碱性SCGE用于辐射损伤快速剂量估算的可行性。随着辐射分子生物学研究的不断深入,越来越多的电离辐射研究转向DNA的损伤和修复。DNA链断裂特别是双链断裂的检测方法是研究辐射损伤的一个关键技术。单细胞凝胶电泳,是20世纪80年代建立起来的检测DNA损伤和修复的敏感技术方法：①用中性单细胞凝胶电泳技术检测辐射诱导的DNA双链断裂,CASP软件分析彗星图像,主要观察彗星尾部DNA%(TDNA%)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)等指标,SPSS 16.0软件拟合剂量-效应曲线。②对离体外周血淋巴细胞不同剂量照射后即刻、3h、24h、48h、72h的中性单细胞凝胶电泳实验,拟合不同剂量的修复曲线方程,进而拟合双链断裂时效性的平面模型。③研究对象分为对照组和放射组；又按照工种,将放射组分为放射诊断组、介入组和骨科组；按照工龄的不同,分为<10、10-和20-36年组。用中性单细胞凝胶电泳对对照组和各放射组进行检测。④应用碱性单细胞凝胶电泳技术(SCGE),采用人外周血离体照射方式,检测受γ射线照射的外周血细胞DNA损伤修复的时间效应和剂量效应关系。试验结果①彗星试验各指标均呈显著剂量-效应关系,以OTM指标的拟合优度最佳。②各个剂量的修复曲线呈较好的线性关系,拟合曲面的光滑度较好。③放射组,与对照组DNA损伤的差异有显著性,放射组的尾部DNA百分含量(TDNA%),尾矩(TM),Olive尾矩(OTM)明显高于对照组,不同工种,工龄间均差异有显著性；介入组高于放射诊断组,放射诊断组高于骨科组。④离体实验结果发现,照射后即刻人外周血细胞尾矩TM值随剂量增加而增加,照射组与未照射组之间差异非常显著P<0.01),剂量效应呈现良好的线性关系Y=0.3619+2.1834D(r=0.9946)；人外周血淋巴细胞尾矩TM照射后6h与朱照射组相比已无显著性差异(P>0.05)结论：①中性单细胞凝胶电泳技术结合CASP软件的应用,可以得出很好的剂量-效应曲线,有望成为新一代辐射生物剂量计。②不同剂量下的损伤修复呈线性关系,修复曲面模型可供辐射原发损伤估算时参考。③长期小剂量电离辐射能引起放射工作人员DNA损伤,随着工龄的增加DNA损伤程度加重。④试验结果表明,碱性单细胞凝胶电泳是一种快速、灵敏检测DNA损伤的有效方法,具有良好的剂量-效应关系；但修复较快,可测时间范围有限。本研究创新之处在于,,中性单细胞凝胶电泳技术的应用,中性SCGE检测DNA的双链断裂,而DNA双链断裂较单链断裂更加稳定,更适合做为检测的对象。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-12
材料与方法  12-29
  1. 实验材料  12-15
    1.1 主要试剂  12
    1.2 主要仪器  12
    1.3 PBS的配置  12-13
    1.4 中和液的配置  13
    1.5 中性裂解液(lysate)  13
    1.6 中性电泳液  13
    1.7 碱性裂解液  13
    1.8 碱性电泳液  13
    1.9 琼脂糖凝胶  13-14
    1.10 EB染色液  14
    1.11 Tris-HCl  14
    1.12 NaOH溶液  14
    1.13 RPMI 1640培养液  14-15
  2. 试验方法  15-29
    2.1 DNA损伤的辐射剂量-效应关系  15-18
      2.1.1 血样采集与照射  15
      2.1.2 淋巴细胞分离  15
      2.1.3 中性单细胞凝胶电泳  15-16
      2.1.4 彗星图像分析  16
      2.1.5 统计学处理  16
      2.1.6 结果  16-17
      2.1.7 讨论  17-18
    2.2 辐射诱导的DNA双链断裂时效性研究  18-20
      2.2.1 血样采集与分组  18
      2.2.2 照射条件  18
      2.2.3 淋巴细胞分离  18
      2.2.4 中性单细胞凝胶电泳实验  18
      2.2.5 彗星图像分析及统计学分析  18-19
      2.2.6 结果  19-20
      2.2.7 讨论  20
    2.3 放射工作人员DNA损伤评价  20-25
      2.3.1 观察对象  20
      2.3.2 试验对象信息采集  20-21
      2.3.3 分组  21-22
      2.3.4 方法  22-23
      2.3.5 实验结果  23-25
      2.3.6 讨论  25
    2.4 碱性SCGE用于辐射损伤快速剂量估算的时效和量效关系研究  25-29
      2.4.1 取血及照射  25-26
      2.4.2 照射条件  26
      2.4.3 淋巴细胞分离  26
      2.4.4 碱性单细胞凝胶电泳  26
      2.4.5 彗星图像分析  26
      2.4.6 结果  26-28
      2.4.7 讨论  28-29
结论  29-30
参考文献  30-33
附录  33-51
综述  51-57
致谢  57-58

单细胞凝胶电泳作为辐射生物剂量计的研究

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