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以procaspase-3为靶点的体外比色法高通量筛选平台的建立

作　者: 阎超
导　师: 杨静玉
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药理学
关键词: 人源重组procaspase-3 caspase-3 PAC-1 比色法体外高通量筛选平台
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究表明Caspase(半胱天冬蛋白酶)家族蛋白在肿瘤细胞凋亡过程中起关键作用。作为效应蛋白,其功能执行需要激活酶原procaspase-3成为有活性的caspase-3。临床研究发现,procaspase-3水平在多种恶性肿瘤细胞中升高,提示其与肿瘤分类、诊断具有内在联系。最近研究发现的小分子化合物PAC-1,具有对procaspase-3直接、高效的活化作用,且对多种肿瘤细胞有显著的抑制活性,裸鼠实验发现,PAC-1可显著性缩小或消除软组织肉瘤、皮肤黑色素瘤和肺癌病灶组织,对正常组织无损伤。提示procaspase-3可能是肿瘤药物作用的新靶点。因此,构建以procaspase-3为靶点的体内外高通量筛选平台将有助于PAC-1类化合物的筛选与构效关系研究,有利于阐明药物作用机制,推进此类化合物的应用开发。本论文基于上述研究背景建立以procaspase-3为活化靶点的高通量比色法体外筛选平台,并进行初步验证,筛选类似PAC-1的procaspase-3激活剂。本研究首先在大肠杆菌中进行procaspase-3蛋白的制备。构建质粒pET-21b-Tag(His)-CPP32,此质粒可表达带组氨酸标签(His-Tag)的人源重组(rch)procaspase-3蛋白。以IPTG诱导pET-21b-Tag(His)-CPP32在大肠杆菌中可溶性表达,采用镍离子螯合层析方法进行分离纯化,通过超滤、真空冻干进一步纯化、浓缩,得到目的蛋白达电泳纯,以Band Scan软件分析,达SDS-PAGE级纯度约80%,每升发酵菌液可制备约6mg蛋白。然后,以所制备的procaspase-3蛋白为工具,建立筛选平台。通过对筛选条件,如激活剂孵育时间、缓冲液的配制、底物浓度选择等的优化,建立了在96孔板上操作,以酶标仪进行检测的高通量比色法。在纯体外蛋白酶水平与HL-60细胞抽提物水平均可进行caspase-3酶活力检测。体外蛋白酶水平,得到PAC-1活化后高酶活力的caspase-3(酶活力4690.52 pmol／min),活化组与对照组相比caspase-3活性升高约2倍,差异具有统计学意义(1.5409±0.01634 VS0.5439±0.11531,P<0.01)；HL-60细胞提取caspase-3水平,酶活力为595.62pmol／min,PAC-1诱导凋亡组与对照组相比,Caspase-3活性升高约1倍,差异具有统计学意义(0.5164±0.0713 VS 0.2549±0.2549,P<0.01)。考查高通量方法评价因子——Z’因子,达0.5以上(在上述两水平分别达0.728,0.573)。该方法稳定、可靠,符合高通量筛选需求。最后,对筛选平台进行初步验证与应用。筛选20种PAC-1衍生物,得到一种有潜在开发价值的化合物。结合Western Blotting(免疫印迹)检测,MTT法进行HL-60细胞水平筛选,辅助确认了该化合物的作用靶点及所建立方法的可靠性。综上所述,本研究建立了以procaspase-3为活化靶点的体外高通量比色法筛选平台,可用于procaspas-3激活剂的筛选。同时建立了在大肠杆菌中制备、纯化procaspase-3蛋白的方法,为进一步研究奠定了基础。

全文目录

中文摘要  10-12
英文摘要  12-14
绪论  14-24
第一章 Procaspase-3蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与分离纯化  24-41
  前言  24-25
  第一节实验材料与方法  25-32
    1 实验材料与仪器  25-26
    2 实验方法  26-32
      2.1 表达质粒pET-21b-Tag_((His))-CPP32的优化构建  26-28
        2.1.1 双酶切获得目的基因CPP32片段  26-27
        2.1.2 表达载体pET-21b(+)的制备  27
        2.1.3 表达载体pET-21b(+)的双酶切  27-28
        2.1.4 连接  28
      2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  28
        2.2.1 用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞  28
        2.2.2 热转化大肠杆菌感受态细胞  28
        2.2.3 含重组质粒的细菌菌落的鉴定  28
      2.3 重组pET-21b-Tag(His)-CPP32的表达验证及可溶性分析  28-30
        2.3.1 表达及可溶性分析  28-29
        2.3.2 SDS-PAGE电泳  29-30
      2.4 目的蛋白的诱导表达与分离纯化  30-32
        2.4.1 目的蛋白的实验室规模发酵制备  30
        2.4.2 Ni-NTA Sepharose Fast Flow柱层析  30-31
        2.4.3 过柱洗脱液的超滤与冻干  31-32
  第二节实验结果  32-38
    1 表达质粒pET-21b-Tag_((His))-CPP32构建  32-34
      1.1 表达质粒pET-21b-Tag_((His))-CPP32构建流程设计  32-33
      1.2 提取质粒后对阳性重组子的验证  33-34
      1.3 菌落菌种保藏后,以T7 promoter为引物测序  34
    2 对阳性克隆重组子的诱导表达验证及可溶性分析  34-35
    3 Ni-NTA Sepharose Fast Flow柱层析及电泳分析结果  35-38
  第三节讨论  38-40
  小结  40-41
第二章建立高通量体外比色法筛选平台  41-59
  前言  41-43
  第一节实验材料与方法  43-48
    1 实验材料与仪器  43-44
    2 实验方法  44-48
      2.1 蛋白质含量测定—Lowry法  44
      2.2 配制各缓冲液  44
      2.3 准备各试剂贮存液  44-45
      2.4 备样  45
      2.5 分组与加样  45-46
      2.6 检测  46
      2.7 数据分析  46
      2.8 HL-60细胞提取蛋白的比色法检测  46-48
  第二节实验结果  48-57
    1 蛋白质含量测定  48
    2 比色法基本组OD值-T曲线与方法评价(Z’因子考察)及组间差异统计  48-50
    3 求caspase-3酶活力  50-51
    4 细胞内提取caspase-3蛋白的活性检测  51-53
    5 不同浓度PAC-1对rch-procaspase-3的体外活化作用  53-55
    6 底物的灵敏、有效性  55-57
  第三节讨论  57-58
  小结  58-59
第三章高通量比色法的初步应用及Western Blotting检测辅助验证靶点等  59-74
  前言  59-60
  第一节实验材料与方法  60-65
    1 实验材料与仪器  60-61
    2 实验方法  61-65
      2.1 Western blot analysis(免疫印迹法)  61-63
        2.1.1 工作液的配制  61-62
        2.1.2 蛋白质电泳  62
        2.1.3 免疫印迹  62-63
      2.2 20种PAC-1衍生物的溶解  63
      2.3 给药处理HL-60细胞  63
      2.4 MTT法检测  63-64
        2.4.1 MTT法的基本原理  63-64
        2.4.2 MTT法的测定方法  64
      2.5 统计方法  64-65
  第二节实验结果  65-72
    1 比色法对20种化合物的筛选结果与分析  65-69
    2 Western Blotting法对化合物WF-210对procaspase-3活化作用的确认  69-70
    3 HL-60水平对20种PAC-1衍生物的筛选与分析  70-72
  第三节讨论  72-73
  小结  73-74
结论  74-75
参考文献  75-82
致谢  82

以procaspase-3为靶点的体外比色法高通量筛选平台的建立

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