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胀果甘草细胞培养及查尔酮合成酶基因的cDNA克隆

作　者: 许恒飞
导　师: 梁玉玲
学　校: 河北大学
专　业: 植物学
关键词: 胀果甘草细胞悬浮培养查尔酮合成酶 cDNA 克隆
分类号: S567.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 34次
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内容摘要

甘草是中国常用的中药,是重要的药用植物。除药用价值外,甘草在食品、饮料、卷烟、化妆品等工业中也广泛使用。近年来,由于人们破坏性地对野生甘草采挖,使野生植物几乎灭绝。故开展甘草组织培养工作,尤其是大规模悬浮培养具有重要意义。黄酮类化合物是甘草中一大类生物活性成分,它们具有抗溃疡、抗菌、抗炎、抗氧化、抗HIV、抗肿瘤等作用。查尔酮合成酶是所有黄酮类化合物合成的关键酶。它催化3分子的丙二酰辅酶A与1分子对羟基苯丙烯酰辅酶A缩合成柚皮素查尔酮,以此为支架其他黄酮类化合物得以衍生出来。查尔酮合成酶活性的积累与黄酮类化合物的积累是紧密相关的。本实验切取胀果甘草无菌苗的子叶、胚轴、根段3种外植体进行了愈伤组织诱导和继代培养,建立了甘草悬浮细胞培养体系,测定了悬浮培养的细胞生长曲线；并且研究了接种量、条件培养基和外源激素对悬浮细胞的影响。结果表明子叶来源的愈伤组织最适合悬浮培养；悬浮培养的最佳接种量为35g/L；条件培养基的最佳用量为总培养体积的1/3；最适合胀果甘草悬浮培养的的培养基是附加NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L激素组合的MS培养基。利用RT-PCR方法,从胀果甘草愈伤组织中克隆了查尔酮合酶基因的cDNA片断,并进行了序列分析。测序结果表明,我们克隆所得到的cDNA片段包含一个开放阅读框架,由1170bp核苷酸组成,编码一个由389个氨基酸残基组成的多肽。与紫花苜蓿、大豆、豌豆等几种豆科植物CHS基因的核苷酸同源率在80%以上,氨基酸同源率在90%以上。已将得到的序列提交GenBank/EMBL/DDBJ注册,序列号为EU706287。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-9
第一章文献综述  9-29
  1.1 甘草的基本特征  9
  1.2 甘草细胞组织培养及其次生代谢产物研究概况  9-21
    1.2.1 植物细胞组织培养生产次生代谢产物  9-10
    1.2.2 甘草细胞组织培养  10-15
    1.2.3 甘草主要次生代谢产物的合成途径  15-18
    1.2.4 甘草细胞组织培养生产其次生代谢产物的研究进展  18-21
  1.3 甘草化学成分研究进展  21-25
    1.3.1 甘草化学成分  21-24
    1.3.2 甘草化学成分的分析和提取技术  24-25
  1.4 查尔酮合成酶基因研究进展  25-28
    1.4.1 查尔酮合成酶基因  25-26
    1.4.2 查尔酮合成酶基因的进化  26
    1.4.3 查尔酮合成酶基因的表达调控  26-27
    1.4.4 查尔酮合成酶基因的应用  27-28
  1.5 本研究的目的及意义  28-29
第二章材料与方法  29-46
  2.1 实验材料  29-34
    2.1.1 植物材料  29
    2.1.2 宿主菌株及质粒载体  29
    2.1.3 实验药品  29-30
    2.1.4 培养基  30
    2.1.5 溶液及缓冲液  30-33
    2.1.6 主要仪器设备  33-34
  2.2 实验方法  34-46
    2.2.1 甘草愈伤组织诱导与继代培养  34-35
    2.2.2 胀果甘草的细胞悬浮培养  35-36
    2.2.3 胀果甘草查尔酮基因的克隆及序列分析  36-46
第三章结果与分析  46-61
  3.1 胀果甘草愈伤组织诱导与继代培养  46-47
    3.1.1 胀果甘草无菌苗的培养  46
    3.1.2 胀果甘草愈伤组织的诱导培养  46
    3.1.3 胀果甘草愈伤组织的继代培养  46-47
    3.1.4 胀果甘草愈伤组织生长发育研究  47
  3.2 胀果甘草悬浮细胞培养  47-52
    3.2.1 胀果甘草悬浮细胞  47-48
    3.2.2 外植体来源对胀果甘草悬浮培养的影响  48-49
    3.2.3 接种量对悬浮培养的影响  49-50
    3.2.4 条件培养对悬浮细胞的影响  50-51
    3.2.5 适合胀果甘草细胞悬浮培养的激素组合及浓度的筛选  51-52
  3.3 胀果甘草查尔酮合成酶基因的cDNA克隆  52-61
    3.3.1 胀果甘草愈伤组织总RNA提取  52-54
    3.3.2 胀果甘草actin基因的PCR扩增  54
    3.3.3 胀果甘草CHS基因的PCR扩增  54-55
    3.3.4 目的基因片段的克隆及鉴定  55-57
    3.3.5 胀果甘草CHS序列的测定及同源性分析  57-61
第四章讨论  61-63
  4.1 胀果甘草愈伤组织的诱导与继代培养  61
  4.2 胀果甘草的细胞悬浮培养  61
  4.3 胀果甘草RNA的提取  61-62
  4.4 胀果甘草查尔酮合成酶基因的cDNA克隆  62
  4.5 对今后工作的几点设想及建议  62-63
    4.5.1 甘草细胞大规模悬浮培养条件的研究  62
    4.5.2 甘草查尔酮合成酶基因植物表达载体的构建  62-63
第五章结论  63-64
参考文献  64-74
致谢  74-75

胀果甘草细胞培养及查尔酮合成酶基因的cDNA克隆

内容摘要

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