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低温胁迫东农冬麦1号SSH文库构建及3个基因表达模式

作　者: 牟永潮
导　师: 苍晶
学　校: 东北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 东农冬麦1号 抗寒基因 抑制消减杂交(SSH) 表达序列标签(EST) 荧光定量PCR
分类号: S512.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


小麦是世界上重要的粮食作物之一,环境胁迫是引起小麦产量降低的最主要限制因素,其中冷胁迫是一种不可忽视的环境限制因子,因冷胁迫造成粮食减产的报道屡见不鲜。因此研究小麦的抗寒机制并从基因表达的整体水平进行探索,对于全面了解作物的抗寒分子基础及培育抗寒作物新品种具有重要意义。本文以东北农业大学选育的冬小麦东农冬麦1号为材料,利用抑制消减杂交的方法构建其分蘖节的低温胁迫SSH-cDNA文库,从培养基上挑取白色菌斑300个进行序列测定,成功返回230个ESTs,其中最短的为103 bp,最长的为1215 bp,平均长度为355 bp。利用BLASTx和tBLASTx对获得的ESTs进行同源性检索分析发现,共有211条为已知序列,占获得全部序列的91.2%。BLASTx比较结果中109条ESTs功能已知,占全部ESTs的18.8%。与BLASTx同源的推测蛋白质序列来自大麦、水稻、小麦、拟南芥、玉米等多个物种。通过对获得的EST序列进行分析,推测众多的表达基因参与了东农冬麦1号的抗寒分子途径,但是具体的抗寒分子过程机制尚不清楚。获得的EST中,Cold shock protein CS66、cystatin、Clp分子伴侣、G-蛋白结合蛋白等基因可能参与了东农冬麦1号的抗寒相关过程。另外,文库中还存在参与其他生物过程的基因,可见在抗寒过程中是多条途径共同发挥作用的,协同而复杂多样。通过实时定量PCR检测文库中3个与抗寒相关基因在强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号和相对弱抗寒品种济麦22两种冬小麦材料中的表达模式发现,3个基因均表现出随温度的下降,表达量上升的趋势。其中在东农冬麦1号中基因上升表达的水平比济麦22强。推测文库中的3个基因在东农冬麦1号抗寒过程中起着重要的作用,为后期的东农冬麦1号抗寒分子研究奠定了基础。

全文目录


中文摘要  8-9
英文摘要  9-12
1. 前言  12-24
  1.1 研究目的及意义  12
  1.2 文献综述  12-23
    1.2.1 与各种逆境相关的转录因子  13-15
    1.2.2 与逆境相关的蛋白因子  15-18
    1.2.3 筛选新基因的方法  18-23
  1.3 实验研究内容及研究路线  23-24
2. 材料与方法  24-36
  2.1 试验材料  24
    2.1.1 冬小麦品种及处理方法  24
    2.1.2 实验试剂  24
    2.1.3 仪器设备  24
  2.2 试验方法  24-36
    2.2.1 总RNA 的提取及检测  24-25
    2.2.2 总RNA 的纯化  25-26
    2.2.3 东农冬麦1 号分蘖节总RNA 中mRNA 的分离  26
    2.2.4 抑制消减杂交  26-30
    2.2.5 PCR 产物的纯化  30
    2.2.6 PCR 产物的载体连接反应  30-31
    2.2.7 文库插入片段大小检测  31
    2.2.8 反向Northern 杂交筛选差异表达基因  31-33
    2.2.9 基因表达模式检测  33-36
3. 结果与分析  36-48
  3.1 SSH 文库构建结果与分析  36-43
    3.1.1 总RNA 提取结果的分析  36
    3.1.2 总RNA 浓度及纯度检测  36-37
    3.1.3 mRNA 的分离检测  37
    3.1.4 抑制消减杂交检测结果  37-43
  3.2 部分基因表达模式结果与分析  43-48
    3.2.1 总RNA 的检测  44
    3.2.2 三个基因的表达模式分析  44-48
4. 讨论  48-53
  4.1 细胞信号通路  48
  4.2 Cor/LEA  48-49
  4.3 分子伴侣  49-50
  4.4 蛋白活性调控  50
  4.5 与发育相关的蛋白基因  50
  4.6 细胞物质运输  50-52
  4.7 核糖体亚基在抗逆中作用  52
  4.8 部分基因的表达模式  52-53
5. 结论  53-54
展望  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-62
附录A  62-66
附录B  66-71
攻读硕士期间发表的论文  71

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦 > 冬小麦
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