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骡鸡的性别鉴定和性别决定候选因子表达的研究

作　者: 丘晓花
导　师: 王嘉福；冉雪琴
学　校: 贵州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 骡鸡性别鉴定 CHD 雌雄同体性别决定 Dmrt1 Sox9 Asw Fet1 芳香化酶
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

骡鸡是乌骨鸡((?))与珍珠鸡((?))通过人工授精产生的杂交体,是一个远缘杂交体,成年骡鸡的性腺发育不完全,从外形上难以区分雌雄性别。本文根据已知禽类CHD基因序列设计了3条引物,采用特异性PCR扩增CHD基因片段,结果表明,这三条引物对已知性别的成年珍珠鸡和乌骨鸡检测结果正确;对珍珠鸡和乌骨鸡的鸡胚性别进行了相应的检测,检测结果与剖检结果相符,证明本文建立的特异性PCR方法可以用于成年鸡和鸡胚的性别鉴定。在此基础上,用此方法鉴定骡鸡及其鸡胚的性别,检测结果表明骡鸡雌雄性别比例均衡,这与雄性骡鸡占较大比例的报道不一致。通过对成年骡鸡的解剖和组织学分析,发现大部分骡鸡的腹腔内同时存在着卵巢和睾丸,为雌雄兼合体。且其卵巢和睾丸都没发育成熟,重量与其亲本的性腺相差较大,睾丸中没有成熟的精子,卵巢中也没成熟的卵母细胞,性腺发育的不成熟是骡鸡不能繁殖的根本原因。与哺乳动物不同,鸟类的性染色体组成是ZZ:ZW,目前其性别决定机制还不完全清楚。是否是Z染色体的剂量效应在鸡的性别决定中起主要作用现在还待解结。鸡DMRT1基因定位在Z染色体上且与W染色体不同源,Dmrt1在胚胎雄性性腺的表达要远远超过雌性性腺,被认为是鸡最重要的雄性决定候选基因。论文选取五个鸟类的性别决定候选因子Dmrt1、Sox9、Asw、Fet1和芳香化酶,以骡鸡为实验材料通过RT-PCR检测这五个因子在性别分化的关键时期(E4.5d-E12.5d)的表达量,比较骡鸡与其亲本之间的表达差异,结果为ZZ/ZW骡鸡的Dmrt1表达量介于父、母本之间,说明Dmrt1表达的上调与骡鸡睾丸的形成有关,而Dmrt1表达的下降与骡鸡卵巢的形成相关；Sox9在ZZ/ZW骡鸡及其父本的睾丸中表达,但骡鸡中的表达时间有所推迟；另外Asw和Fet1在E4.5检测到转录本,芳香化酶出现时间比较迟,Asw在ZW骡鸡和母本卵巢中特异表达,但ZW骡鸡的卵巢发育是不完全的；本文中Fet1的研究结果与已知不同,Fet1并非在雌性中特异表达,在家鸡和ZZ骡鸡的睾丸中都检测到Fet1的转录本。这些结果表明在鸡性别决定中Dmrt1表达量上调与Z染色体的数量无关；在性别决定的关键时期,ZW基因型个体中Dmrt1表达量的下调促使卵巢发育,ZZ基因型个体Dmrt1表达的急剧增加和Sox9的共同作用使睾丸分化；Fet1、Asw和芳香化酶可能影响卵巢的发育或维持卵巢的形态,但它们不是鸡性别决定的主要因子。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
第一章前言  8-24
  1.1 远缘杂交研究进展  8-10
    1.1.1 远缘杂交的应用  8-9
    1.1.2 远缘杂交不亲和性和杂交种不育  9-10
  1.2 骡鸡远缘杂交研究现状  10-12
  1.3 鸟类性别鉴定研究进展  12-15
    1.3.1 常规雌雄鉴别方法  12
    1.3.2 细胞学水平上的性别鉴定技术  12-13
    1.3.3 DNA分子水平性别鉴定技术  13-15
      1.3.3.1 CHD-W基因鉴定  14
      1.3.3.2 ATP5AI基因  14-15
      1.3.3.3 EE0.6序列  15
  1.4 鸟类性别决定的研究进展  15-23
    1.4.1 性别的形成与分化  16-17
    1.4.2 性别决定与性别分化机制  17-23
  1.5 结语  23-24
第二章论文研究的目的和意义  24-25
第三章材料和方法  25-44
  一、材料  25-31
    1.实验材料  25
    2.分子生物学用酶及试剂盒等  25-26
    3.质粒和菌种  26
    4.主要溶液  26-29
    5.抗生素及其工作浓度  29
    6.主要仪器  29-30
    7.常用的生物信息分析的相关软件及网站  30-31
  二、方法  31-44
    A.技术路线  31-32
    B.引物的设计与合成  32
    C.骡鸡性别的分子鉴定  32-35
    D.成年骡鸡性腺的组织学观察  35-37
    E.五个性别决定候选因子的克隆和表达检测  37-44
第四章结果  44-63
  1.骡鸡性别的分子鉴定  44-45
  2.成年骡鸡性腺的组织学观察  45-47
    2.1 成年骡鸡的解剖结果  45
    2.2 组织学分析  45-47
  3.五个性别决定候选因子的克隆和表达检测  47-63
    3.1 PCR扩增结果  47-48
    3.2 重组质粒的构建  48-50
    3.3 各候选基因的核苷酸序列测定及同源性比较  50-52
    3.4 样品总RNA的检测  52-53
    3.5 PCR扩增结果  53-58
    3.6 各性别决定候选因子在E4.5d-E12.5d鸡胚性腺中mRNA的表达水平分析  58-62
    3.7 各性别决定候选因子成年鸡性腺mRNA的表达水平分析  62-63
第五章讨论  63-66
小结  66-67
参考文献  67-74
缩写词表  74-75
附录  75-76
致谢  76-77

骡鸡的性别鉴定和性别决定候选因子表达的研究

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