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稀有鮈鲫性别分化相关基因的克隆与分析

作　者: 曹梦西
导　师: 赵浩斌
学　校: 华中师范大学
专　业: 动物学
关键词: 稀有鮈鲫 Cyp19a Cyp19b dmrt1 克隆表达模式性别决定模式性别分化转基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

稀有鮈鲫为我国特有的实验动物,其性别分化机制亦不清楚。为了了解稀有鮈鲫的性别决定模式和性别分化的分子基础,本研究进行了稀有鮈鲫激素处理及其后代分析,克隆和分析了与性别分化紧密相关的部分基因如卵巢型与脑型芳香化酶基因及dmrt1。初步研究了芳香化酶基因和dmrt1在稀有鮈鲫性别决定及分化过程中的作用,对稀有鮈鲫性别决定模式进行了初步探讨。一、采用RT-PCR和RACE方法,获得稀有鮈鲫性腺型芳香化酶基因(Cyp19a),其长度为2246bp,编码520个氨基酸残基,具有典型的芳香化酶结构域。RT-PCR分析发现该基因特异表达于性腺,且卵巢中表达量高于精巢中。胚胎发育不同时期检测发现,Cyp19a的表达从囊胚期开始,至出苗5天均维持在稳定的低表达水平,出苗10天后有所增强并维持在该水平。说明Cyp19a特异表达于性腺,推测其直接参与性腺中雌激素的合成过程,对性腺的发育和分化起重要作用。二、采用RT-PCR和RACE的方法,,获得稀有鮈鲫脑型芳香化酶基因(Cyp19b)全序列,其长度为2191 bp,编码507个氨基酸残基,具有典型的芳香化酶结构域。RT-PCR分析发现该基因主要在稀有鮈鲫的脑中表达,在性腺、肠、肾中也有表达。在胚胎发育阶段,Cyp19b的表达从囊胚期开始,至神经胚期达到较高水平,随后下降,孵化期又有所增强,孵化10天后维持在高水平。这些结果说明Cyp19b主要在脑中表达,可能在稀有鮈鲫神经系统发育和脑的性别分化中起重要作用。三、采用RT-PCR和RACE方法,获得稀有鮈鲫dmrt1基因全长,其长度为2098bp,编码266个氨基酸残基,具有典型的DM结构域。RT-PCR分析发现该基因特异表达于性腺,但精巢中表达量高于卵巢。胚胎发育不同时期检测发现,dmrt1为一母源性基因,其表达从合子期开始,并且维持较稳定的高水平表达。表明dmrt1可能参与早期性别决定的发生和发育调控过程。四、对3个基因在幼鱼不同发育阶段单个个体的表达情况的研究表明,出苗25天,Cyp19a出现第一个表达高峰,此时Cyp19b表达水平也有所上升,但不显著。40天时dmrt1出现第一个表达高峰。3个基因在第25天、45天、50天时出现较强的个体差异性,且芳香化酶基因与dmrt1在个体中的表达呈现相反趋势。出苗后10天,芳香化酶基因表达量较之出苗之前各发育时期显著升高,且Cyp19a/dmrt1的相对表达出现个体差异。推测稀有鮈鲫的性别分化关键时期为孵化后的10-25天,从出苗后45天-50天可能是性别分化的完成时期。而且推断稀有鮈鲫在性别未分化前,可能以卵巢的形态出现。性腺的分化从10天左右开始,而向卵巢方向的快速分化可能从25天开始,向精巢的分化发育从40天开始。五、利用性逆转的方法,通过激素处理成功获得性反转个体,与正常个体交配后,得到全雄子代。推测稀有鮈鲫的性别遗传决定型为雄性同配型(ZZ/ZW型)。六、通过胚胎显微注射的方法,成功获得转Cyp19a-GFP稀有鮈鲫,为进一步研究Cyp19a在稀有鮈鲫性别分化过程中的作用奠定基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
1.前言  11-18
  1.1 鱼类的性别决定与分化  11-16
    1.1.1 性别决定与分化概述  11-12
    1.1.2 鱼类性别决定模式及其研究方法  12-14
    1.1.3 性别分化相关基因研究进展  14-16
  1.2 稀有鮈鲫——理想的实验动物模型  16-17
    1.2.1 稀有鮈鲫的生物学特征  16-17
    1.2.2 稀有鮈鲫性别相关研究进展  17
  1.3 本研究立题的必要性  17-18
2.材料和方法  18-29
  2.1 实验材料及引物序列  18-19
  2.2 主要仪器设备  19
  2.3 主要试剂  19-20
  2.4 实验方法  20-29
    2.4.1 实验鱼的激素处理及杂交试验  20
    2.4.2 RNA的提取  20-22
    2.4.3 DNA的提取  22
    2.4.4 cDNA第一链的合成  22
    2.4.5 RT-PCR扩增基因cDNA片段  22-23
    2.4.6 纯化PCR产物  23
    2.4.7 感受态细胞的制备  23-24
    2.4.8 目的DNA片段与pMD 18-T载体的连接  24
    2.4.9 转化及筛选  24
    2.4.10 转基因质粒的提取、酶切及纯化  24-25
    2.4.11 RACE-PCR克隆基因全长  25-27
    2.4.12 序列分析  27
    2.4.13 RT-PCR表达检测与分析  27-28
    2.4.14 胚胎显微注射及转基因稀有鮈鲫的检测  28-29
3.结果  29-60
  3.1 稀有鮈鲫两种芳香化酶基因cDNA的克隆及序列分析  29-42
    3.1.1 Cyp19a、Cyp19b基因片段的克隆  29-31
    3.1.2 RACE-PCR扩增Cyp19a、Cyp19b的全长  31-36
    3.1.3 Cyp19a、Cyp19b的cDNA序列分析  36-42
  3.2 稀有鮈鲫dmrt1基因EDNA的克隆及序列分析  42-48
    3.2.1 RACE-PCR扩增dmrt1基因全长  42-45
    3.2.2 dmrt1基因的cDNA序列分析  45-48
  3.3 Cyp19a、Cyp19b及dmrt1基因的表达模式分析  48-55
    3.3.1 Cyp19a、Cyp19b及dmrt1基因的组织表达分析  48-50
    3.3.2 Cyp19a、Cyp19b及dmrt1基因在胚胎发育早期的表达分析  50-52
    3.3.3 Cyp19a、Cyp19b及dmrt1基因在单个幼鱼发育过程中的表达分析  52-55
  3.4 稀有鮈鲫性别决定模式的研究  55-57
    3.4.1 激素处理性反转稀有鮈鲫的获得  55-56
    3.4.2 杂交试验结果  56-57
  3.5 转Cyp19a-GFP基因鱼获得  57-60
4.讨论  60-66
  4.1 稀有鮈鲫Cyp19a、Cyp19b、dmrt1的序列分析  60
  4.2 稀有鮈鲫Cyp19a、Cyp19b、dmrt1的表达分析  60-64
    4.2.1 Cyp19a的表达分析  60-61
    4.2.2 Cyp19b的表达分析  61-63
    4.2.3 dmrt1的表达分析  63-64
  4.3 转Cyp19a-GFP稀有鮈鲫  64
  4.4 稀有鮈鲫的性别决定模式  64-66
参考文献  66-75
在校期间论文发表情况  75-76
致谢  76

稀有鮈鲫性别分化相关基因的克隆与分析

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