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七种贵州地方猪品种的三种遗传缺陷主效基因多态性研究

作　者: 朱锋钊
导　师: 冉雪琴；王嘉福
学　校: 贵州大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 贵州地方猪 遗传缺陷 RYR1 ApoB CD18 多态性
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


猪的遗传缺陷是由于猪生殖细胞或受精卵中的遗传物质在结构或功能上发生了改变,从而使发育的个体表现出的缺陷或异常。部分遗传缺陷可造成明显的性状变化,严重影响养猪业的发展。为了探索贵州地方猪品种中遗传缺陷的发生状况,选取七个贵州地方猪品种柯乐猪、糯谷猪、萝卜猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪作为试验样本,以大白猪、太湖猪和二个杂交猪群（杜洛克×长白猪×大白猪和长白猪×大白猪）作为对照,着重研究三种遗传缺陷猪应激综合征、载脂蛋白缺陷症和白细胞粘附缺陷症的主效基因兰尼定受体1基因（RYR1）、载脂蛋白B基因（ApoB）和白细胞表面的粘附分子CD18,分析这些基因的基因型、发生频率及其分布规律。采用PCR-RFLP、PCR-SSCP和AS-PCR方法研究7个贵州地方猪RYR1基因、ApoB基因和CD18基因的多态性,主要结果如下:1.从245份贵州地方猪品种样本和157份对照组猪品种样本中,检测到猪应激综合征主效基因的两种基因型:野生型RYR1NN和杂合基因型RYR1Nn,没有检测到隐性的纯合基因型RYR1nn。将扩增片段克隆测序后证实RYR1基因编码区第1843位碱基发生了多态性变化:RYR1NN基因型的碱基均为C;RYR1Nn基因型的碱基为C或T,C/T突变导致RYR1基因编码区615位氨基酸由精氨酸（Arg）突变为半胱氨酸（Cys）。所检测的糯谷猪、萝卜猪、宗地花猪、香猪、关岭猪和黔南黑猪6种贵州地方猪品种均为野生型RYR1NM,自柯乐猪中检测到一个杂合基因型RYR1Nn,杂合基因型频率为2.08%;对照组中,外三元、外二元杂交猪、大白猪和太湖猪中均检测到RYR1Nn基因型,杂合基因型频率分别为11.11%、12.12%、5.77%和11.11%,明显高于贵州地方猪品种（P＜0.05）;相应的,对照组中外三元、外二元杂交猪、大白猪和太湖猪中的n等位基因频率明显高于贵州地方猪品种（P＜0.05）。2.研究了贵州地方猪和欧洲猪品种ApoB基因片段的PCR-RFLP和PCR-SSCP多态性,从245份贵州地方猪品种样本和157份对照组猪品种样本中只检测到一种带型,均为AA基因型（野生型）,没有多态性。即载脂蛋白与低密度脂蛋白（LDL）受体结合领域未发生点突变（Arg 3500Gln）。说明从人的ApoB基因中发现的碱基突变在猪群中的自然发生率低,该位点在贵州地方猪品种群体中保守。3.用AS-PCR和PCR-RFLP方法对245份贵州地方猪品种样本和157份对照组猪品种样本CD18基因进行了研究,发现所有样本均为杂合型CD18Aa。碱基序列分析证实CD18基因编码区383位碱基由A突变为G,相应的位于胞外高度保守区的128位天冬氨酸（Asp）变成了甘氨酸（Gly）。贵州地方猪品种均为杂合基因型CD18Aa,未表现出明显的病变,提示CD18基因的多态性与疾病的相关性具有种属特异性。本文对七个贵州地方猪品种的三种遗传缺陷的突变频率及其分布进行了研究,可为贵州地方猪品种的选育和保护提供理论依据。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
一 前言  10-23
  1.1 猪的遗传缺陷概述  10-11
    1.1.1 遗传缺陷  10
    1.1.2 染色体病  10
    1.1.3 单基因遗传缺陷  10
    1.1.4 多基因遗传缺陷  10-11
  1.2 猪应激综合征主效基因RYR1基因研究进展  11-12
    1.2.1 猪应激综合征产生的原因  11
    1.2.2 RYR1基因的结构、功能及其染色体定位  11-12
    1.2.3 RYR1基因隐形突变的检测及其原理  12
  1.3 猪载脂蛋白缺陷的研究进展  12-13
    1.3.1 猪载脂蛋白缺陷产生的原因  12
    1.3.2 ApoB基因的结构及其染色体定位  12-13
  1.4 猪白细胞粘附缺陷的研究进展  13-14
    1.4.1 猪白细胞粘附缺陷及其产生的原因  13
    1.4.2 CD18基因的结构、功能及其染色体定位  13-14
    1.4.3 CD18基因A383G突变的检测  14
  1.5 DNA多态性检测方法  14-19
    1.5.1 限制性内切酶片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)  14-15
    1.5.2 单链构象多态性(PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)  15-17
    1.5.3 等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)  17
    1.5.4 四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)  17-18
    1.5.5 随机引物扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)  18-19
  1.6 贵州地方猪品种  19-23
    1.6.1 黔北型地方猪  19-20
    1.6.2 黔西北高原型地方猪  20-21
    1.6.3 黔中型地方猪  21
    1.6.4 黔东型地方猪  21-22
    1.6.5 黔东型边缘小型香猪  22-23
二 研究的目的与意义  23-24
三 材料与方法  24-42
  3.1 实验材料  24-28
    3.1.1 实验样本的来源及采样方法  24
    3.1.2 主要试剂  24-25
    3.1.3 主要实验仪器  25-26
    3.1.4 抽提基因组DNA溶液和试剂配制  26
    3.1.5 琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂  26-27
    3.1.6 感受态细胞制备及转化相关试剂  27-28
  3.2 实验方法  28-40
    3.2.1 基因组DNA的提取  28-29
    3.2.2 PCR引物的选择及PCR反应条件的确定  29-32
    3.2.3 PCR产物的检测  32-33
    3.2.4 RYR1基因的PCR-RFLP分析  33-34
    3.2.5 ApoB基因的PCR-RFLP分析  34
    3.2.6 ApoB基因的PCR-SSCP分析  34-36
    3.2.7 CD18基因的AS-PCR检测  36
    3.2.8 CD18基因的PCR-RFLP分析  36-37
    3.2.9 PCR产物的纯化回收  37-38
    3.2.10 克隆载体  38
    3.2.11 纯化的PCR产物与载体的连接  38
    3.2.12 感受态细胞的制备  38-39
    3.2.13 转化实验  39
    3.2.14 阳性菌落的筛选与鉴定  39-40
  3.3 碱基序列的测定与保种  40
  3.4 统计分析  40-41
    3.4.1 基因型频率和基因频率  40-41
    3.4.2 杂合度和有效等位基因数的计算  41
  3.5 分析软件  41-42
四 结果  42-55
  4.1 基因组DNA提取结果  42
  4.2 RYR1基因片段的扩增与多态性检测  42-48
    4.2.1 RYR1基因片段PCR的扩增结果  42-43
    4.2.2 重组质粒的构建和鉴定  43-45
    4.2.3 RYR1基因片段的核苷酸序列测定及分析  45
    4.2.4 RYR1基因片段PCR-RFLP多态性的检测  45-46
    4.2.5 RYR1不同基因型的碱基序列分析  46-47
    4.2.6 RYR1基因型频率和基因频率  47-48
  4.3 ApoB基因片段的扩增及多态性检测  48-51
    4.3.1 ApoB基因片段扩增  48-49
    4.3.2 ApoB基因片段PCR-RFLP分析  49-50
    4.3.3 ApoB基因片段PCR-SSCP分析  50
    4.3.4 ApoB基因片段多态性检测结果与分析  50-51
  4.4 CD18基因片段的扩增及多态性检测  51-55
    4.4.1 CD18基因片段AS-PCR检测  51
    4.4.2 重组质粒的构建和鉴定  51-52
    4.4.3 CD18不同基因型的碱基序列分析  52-53
    4.4.4 CD18基因片段PCR扩增  53-54
    4.4.5 CD18基因片段的PCR-RFLP多态性检测  54
    4.4.6 CD18基因片段多态性检测结果与分析  54-55
五 讨论  55-60
  5.1 实验材料的选择  55
  5.2 贵州地方猪品种RYR1基因多态性分析  55-57
  5.3 太湖猪RYR1基因多态性分析  57
  5.4 贵州地方猪品种ApoB基因的多态性分析  57-58
  5.5 贵州地方猪品种CD18基因的多态性分析  58-60
小结  60-61
参考文献  61-69
缩略语表  69-70
附录  70-71
致谢  71-73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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