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猪沙门菌转运鸡GM-CSF和鸡IL-18真核表达质粒的实验研究

作　者: 王亚
导　师: 余兴龙
学　校: 湖南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪霍乱沙门菌C500弱毒株载体鸡GM-CSF 鸡IL-18 免疫佐剂
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪霍乱沙门菌C500弱毒株是预防仔猪副伤寒的高效、安全的疫苗株。用其作载体,将含外源基因的真核表达质粒携带到宿主体内并表达外源蛋白,激活免疫系统,引起免疫反应。其独特的优点体现在既可作为针对沙门菌抗原的活疫苗,也可作为外源基因的活载体,并以其菌体成份的佐剂属性,增强机体的免疫应答反应。本实验利用DNA重组技术将鸡粒/巨噬细胞集落刺激因子基因（CGM-CSF）与鸡白细胞介素18基因（CIL-18）,克隆到真核表达载体pVAX1上,构建得到真核表达质粒pVAX1-CGMCSF:pVAX1-CIL18;pVAX1-CGMCSF/CIL-18。并将这3种质粒以及空质粒pVAX1分别转化C500菌。通过将C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）和C500（pVAX1）体外培养和体内接种的方法,研究该真核表达质粒在体外和体内的稳定性,以及重组菌在体内的消长动态。同时将重组菌C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）和C500（pVAX1）分别以10⁸、10⁹、10¹⁰CFU/只的剂量口服接种雏鸡,并在雏鸡体内传代接种的方法,研究该重组菌对雏鸡的安全性。结果显示重组菌在体外培养过程中,外界无抗性选择压力条件下,所携带质粒在重组菌中的稳定性也会随之降低。外界有抗性选择压力条件下,所携带质粒在重组菌传代过程中的稳定性于第8代后出现下降明显的趋势。在体内接种过程中,粪便分离菌通过酶切鉴定,血液,肝脏,脾脏,肠道粘膜所提DNA通过PCR鉴定均能获得清晰的目的条带,表明重组菌能将目的基因转运机体细胞内。将重组菌C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）和C500（pVAX1）以10⁹CFU/只剂量口服接种雏鸡后,分别从脏器指数、鸡脾细胞增殖试验和碳粒廓清指数三个方面检测重组菌免疫后对雏鸡免疫功能的影响,结果显示了免疫功能指标均呈现重组菌C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）组高于重组菌C500（pVAX1）组并显著高于对照组（p＜0.05）,表明重组菌接种后,进入体内释放出真核表达质粒,并能表达外源基因,促进雏鸡免疫器官的发育,提高机体的免疫功能。在此基础上,将C500（pVAX1）;C500（pVAX1-CGMCSF）;C500（pVAX1-CIL18）:C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）分别免疫4组雏鸡,每组10只,于重组菌接种后1周各组以0.2ml/羽的剂量颈部皮下注射禽流感油乳剂灭活苗,设立PBS+灭活苗对照组,分别于免疫前、免疫后每隔1周翅静脉采血,通过间接血凝抑制试验检测血清抗体血凝抑制效价。结果显示了C500（pVAX1）;C500（pVAX1-CGMCSF）:C500（pVAX1-CIL18）;C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）均能提高鸡群免疫灭活苗后的抗体效价,免疫后7天、14天、21天、28天C500（pVAX1-CGMCSF/CIL-18）组的血凝抑制效价均显著高于PBS对照组（P＜0.05）;C500（pVAX1-CGMCSF）组和C500（pVAX1-CIL18）组在免疫后7天、14天、21天血凝抑制效价显著高于PBS对照组（P＜0.05）,免疫后28天差异均不显著（P＞0.05）。表明用猪霍乱沙门菌C500弱毒株能将基因转运至机体内,携带的GM-CSF,IL-18可有效提高鸡的免疫功能和抗体水平,发挥了细胞因子GM-CSF和IL-18的免疫佐剂作用,为细胞因子之间的协同作用提供了实践依据。

猪沙门菌转运鸡GM-CSF和鸡IL-18真核表达质粒的实验研究

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