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中国合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的克隆及基因结构与多态性分析
作 者: 莫斯科
导 师: 景志忠;吴润
学 校: 甘肃农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 中国合作猪 SLA I类和II类基因 上游启动子区 多态性
分类号: S828
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
主要组织相容性复合体(Major histocopitibility complex,MHC)又称白细胞抗原(LymphocyteAntigen),是集中于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因簇,是目前已知的多态性最丰富的基因系统。MHC不仅控制着机体移植排斥反应,还参与机体对内/外源性抗原的识别、结合,与机体获得性免疫应答密切相关。MHC在人类称为HLA,在猪则称为SLA(swine Lymphocyte Antigen),其中SLAⅠ类和SLAⅡ类是其最重要的经典分子。中国合作猪是由野猪通过自然驯化和人工选择而来的一个地方猪种,主要分布于甘肃省甘南藏族自治州等高原地区,是一个原始地方小型猪种。由于独特的高原气候类型和复杂多样的地形地貌特征,加之交通闭塞、地理隔离以及民族特有的经济、文化活动,保存了许多独特而优秀的遗传性状,耐粗饲、耐严寒、抗病力强,其特有的基因型是其他猪种所不具备的,是我国重要的遗传多样性基因资源库。本研究以商品化白猪和GenBank收录的相关物种的SLA基因作为比较对象,重点研究合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的基因结构及其遗传多态性,探讨其独特的生物学特性与该类分子的关系,为抗病基础研究提供依据。取得的研究结果如下:1、首次成功地克隆了合作猪和商品化白猪SLAⅠ类(SLA-1、-2和-3)和Ⅱ类(DRA、DRB、DQA和DQB)分子的功能基因及其相应的基因组序列,其中SLAⅠ类分子功能基因序列共6个(GenBank登录号为FJ905817~FJ905822),相应的基因组序列6个(GenBank登录号为FJ905829~FJ905834);SLAⅡ类分子功能基因序列共8个(GenBank登录号分别为FJ905823、FJ905824~FJ905828),相应的基因组序列7个(GenBank登录号为FJ905835~FJ905840)。2、系统分析合作猪和商品化白猪SLAⅠ类基因的结构及其多态性,发现SLAⅠ类分子基因可分为五个功能区,其多态性位点主要集中在α1与α2结构域,其中核苷酸非同义置换位点数多于同义置换位点数。SLAⅠ类分子共有21个新的SNPs位点,其中SLA-1有4个,主要位于α2和α3功能区;SLA-2有6个,主要位于α1、α2和α3功能区;SLA-3有13个,主要位于α2和α3功能区。合作猪SLAⅠ类分子共有17个新的SNPs位点,而商品化白猪有6个,说明合作猪的SLAⅠ类分子多态性高于商品化白猪。3、系统分析合作猪和商品化白猪SLAⅡ类基因的结构及其多态性,发现SLAⅡ类分子基因可分为四个功能区,其多态性位点主要集中在α1(β1)结构域,其中DRAα1区仅有一个非同义置换位点,而DQAαβ1区的同义置换位点数多于非同义置换位点数;DRB和DQB的β1区的核苷酸同义置换位点数少于非同义置换位点数。SLAⅡ类分子共有23个新的SNPs位点,其中DRA有5个,主要位于α1区;DQA有6个,主要位于α1和α2功能区;DQB有4个,主要位于β1区、信号肽和穿膜区及胞浆区;DRB有7个,主要位于β1、β2区和穿膜区及胞浆区。合作猪SLAⅡ类分子共有9个新的SNPs位点,而商品化白猪共有13个,说明商品化白猪SLAⅡ类分子的多态性高于合作猪。4、合作猪和商品化白猪SLAⅠ类分子的基因组均由8个外显子和7个内含子组成,基因组结构相似,其中Ⅰ类分子中内含子3片段最长;而SLAⅡ类分子α、β链的外显子和内含子组成有差异,其中DRA和DQA由4个外显子和3个内含子组成,DQB由5个外显子和4个内含子组成,DRB则由6个外显子和5个内含子组成。在SLAⅡ类分子中,DRA、DRB和DOA的内含子1均长丁其他内含子,而DQB较为特别,其内含子2较长。5、合作猪SLAⅠ类分子基因组外显子2和3共有14个新的SNPs位点,其中SLA-2有7个新的SNPs位点主要位于α2功能区,SLA-3有7个新的SNPs位点主要位于α2和α3功能区。而SLAⅡ类分子基因组外显子2共有3个新的SNPs位点,其中DQB有2个新的SNPs位点主要位于β1区,而DRB仅有1个新的SNPs位点主要位于β1区。而Ⅰ类分子基因组的内含子2和3的多态性比较,发现存在单个核苷酸的变异和短片段的缺失。DRA和DQA的内含子1的多态性主要表现也为单个核苷酸的变异和短片段的缺失,但DRB基因内含子1的多态性主要表现为200多个bp长片段序列的插入和缺失,在DQB的内含子2同样具有连续的10多个核苷酸的插入和缺失现象,且其多次出现。因此,合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的内含子组成具有高度的多态性,并远高于其外显子。6、首次完整地克隆和分析了合作猪和商品化白猪SLAⅠ类(SLA-1、-2和-3)和Ⅱ类分子基因(DRA、DRB、DQA和DQB)的上游启动子调控区,并与HLAⅠ类和Ⅱ类分子基因的上游调控区比较,证实其结构类型和排列顺序基本一致。发现SLAⅠ类(SLA-1、-2和-3)基因表达调控有关的调控元件含有SP1、增强子A、干扰素调控因子(ISRE)、W/S盒、X盒、Y盒、CAAT盒和TATA盒,其中CAAT盒高度保守,而其他调控元件均具有多态性;而SLAⅡ类分子基因表达调控有关的元件在基因间则不一致,其中SLA-DRA上游调控区含有部分的Y盒、八聚体复合物和T区等调控因子,均高度保守,但没有发现CCAAT和TATA等区;SLA-DQA上游调控区含有W盒、核因子κ((NF-κB)/增强子A、S盒、X盒、Y盒和T盒,仅W盒具有多态性;而SLA-DQB和-DRB基因表达调控有关的调控元件一致,均含有W/S盒、X盒、Y盒、CCAAT和TATA盒,其中仅CCAAT盒高度保守,其他均具有多态性。此外,在各调控元件之间分布着多态性位点。7、SLAⅠ类分子基因启动子区多态性分析发现,与参考序列比较共有23个新的SNPs位点,其中合作猪与商品化白猪SLA-2-URR间有14个,主要位于各调控元件之间;合作猪SLA-3-URR有9个新的SNPs位点和1个缺失位点,主要位于各调控元件之间和增强子A及SP1盒中。在SLAⅠ类分子基因启动子区的23个多态性位点中,合作猪有19个,而商品化白猪仅有4个。SLAⅡ类分子基因启动子区共有13个新的SNPs位点,其中DQA-URR有5个,主要位于W盒和W盒:DRB-URR共有8个,主要位于各调控元件之间。说明合作猪SLAⅠ类、Ⅱ类分子基因启动子区具有多态性,且在SLAⅠ类分子高于商品化白猪。8、选择合作猪SLAⅡ类分子的DQA外显子2进行遗传演化关系分析,发现AT含量大于GC含量,核苷酸的非同义置换率高于同义置换率,且ka/Ks<1,说明DQA基因外显子2序列经受着平衡选择且偏向于阴性选择的影响;用Tajima’s D值进行中性检验发现,Tajima’s D值为0.54649>0.1(P>0.10)符合中性突变,说明平衡选择对DQA的进化具有重要的意义,基因序列进化方式为平衡选择,而且有一些单倍型的分化。每个位点的核苷酸置换率Pi(π)和Theta-W的值分别为0.04016和0.03694,且平均碱基配对遗传距离为0.0418±0.0081。总之,对合作猪白细胞抗原的Ⅰ类和Ⅱ类分子基因的分析表明:SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因具有丰富的多态性,且具有单倍型的分化,说明合作猪具有独特的基因型,这可能与其长期适应各种恶劣的自然环境和复杂的病原微生物有关。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-14 第一部分 文献综述 14-34 第一章 猪MHC分子的研究进展 14-21 1.1 猪MHC的发现及特点 14 1.1.1 MHC的发现 14 1.1.2 猪MHC的发现 14 1.2 猪MHC(SLA)的生物学功能 14-16 1.2.1 参与T细胞的免疫应答 15 1.2.2 参与免疫应答的遗传控制 15 1.2.3 约束免疫细胞间的相互作用 15 1.2.4 参与抗原处理 15 1.2.5 参与免疫调节 15-16 1.2.6 参与免疫细胞的分化 16 1.3 SLA分类、特点及组成 16-21 1.3.1 SLAⅠ类分子的分布、特点及组成 16-18 1.3.2 SLAⅡ类分子的分布、特点及组成 18-21 第二章 猪MHC分子的多态性 21-29 2.1 猪MHC的多态性 21 2.2 SLAⅠ类分子基因及启动子区的多态性 21-23 2.2.1 SLAⅠ类分子基因的多态性 21-22 2.2.2 SLAⅠ类基因启动子区多态性 22-23 2.3 SLAⅡ类分子及启动子区基因多态性 23-29 2.3.1 SLAⅡ类分子基因的多态性 23-24 2.3.2 SLAⅡ类基因启动子区的多态性 24-27 2.3.3 MHCⅡ类基因启动子的多态性对基因表达调控影响 27 2.3.4 MHCⅡ类基因启动子多态性的的形成及与疾病的相关性 27-29 第三章 SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因与疾病及生产性状的相关性 29-34 3.1 SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因组织、细胞表达及与机体免疫水平的相关性 29 3.2 SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因与疾病的相关性 29-32 3.3 SLA与生产性状的相关性 32 3.4 前景展望 32-34 第二部分 试验研究 34-149 第四章 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子CDNA的克隆及序列分析 34-74 4.1 实验材料 34-36 4.1.1 实验动物 34 4.1.2 菌种和载体 34 4.1.3 酶和试剂 34-35 4.1.4 仪器与设备 35 4.1.5 引物 35-36 4.2 实验方法 36-41 4.2.1 猪脾脏淋巴细胞的分离与培养 36 4.2.2 总RNA的提取 36-37 4.2.3 RT-PCR扩增目的片段 37-39 4.2.4 目的基因的克隆 39-40 4.2.5 重组质粒的提取与鉴定 40-41 4.3 结果与分析 41-71 4.3.1 RT-PCR扩增产物 41-43 4.3.2 重组质粒的酶切鉴定 43-44 4.3.3 测序结果 44-45 4.3.4 SLA Ⅰ类分子功能基因的序列分析 45-58 4.3.5 SLA Ⅱ类分子功能基因的序列分析 58-67 4.3.6 合作猪DR基因的生物信息学分析 67-71 4.4 讨论 71-74 4.4.1 关于SLA Ⅰ和Ⅱ类分子功能基因序列cDNA水平多态性的探讨 71-72 4.4.2 SLA Ⅰ和Ⅱ类分子功能基因多态性对其功能的影响 72 4.4.3 合作猪DR基因与不同猪种和物种间的同源关系的比较 72-74 第五章 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测分析 74-90 5.1 实验材料 74 5.2 方法 74 5.3 结果与分析 74-89 5.3.1 测序结果 74 5.3.2 SLAⅠ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测分析 74-89 5.4 讨论 89-90 5.4.1 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子等位基因新的SNPs位点的预测 89 5.4.2 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测 89-90 第六章 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子基因组DNA的克隆及序列分析 90-127 6.1 实验材料 90-92 6.1.1 实验动物 90 6.1.2 菌种和载体 90 6.1.3 酶和试剂 90-91 6.1.4 仪器与设备 91 6.1.5 引物 91-92 6.2 实验方法 92-95 6.2.1 猪脾脏淋巴细胞的分离与培养 92 6.2.2 基因组DNA的提取 92-93 6.2.3 SLA基因组的扩增 93 6.2.4 目的片段的克隆 93-95 6.2.5 重组质粒的提取与鉴定 95 6.3 结果与分析 95-122 6.3.1 提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 95-96 6.3.2 合作猪与商品化白猪MHC基因PCR产物 96-98 6.3.3 重组质粒的酶切鉴定 98-100 6.3.4 测序结果 100-101 6.3.5 合作猪和商品化白猪SLAⅠ类分子基因组序列的分析及新等位基因的预测 101-109 6.3.6 合作猪和商品化白猪SLAⅡ类功能基因组序列的分析 109-119 6.3.7 合作猪DRB基因外显子2序列遗传变异的分析 119-121 6.3.8 合作猪DQA外显子2的多态性及其遗传进化的分析 121-122 6.4 讨论 122-127 6.4.1 关于长片段基因组的克隆的探讨 122-123 6.4.2 关于SLAⅠ类分子基因组的结构及其多态性的分析 123 6.4.3 关于SLAⅡ类分子基因组的结构及其多态性的分析 123-124 6.4.4 关于合作猪DRB基因外显子2的多态性的分析 124 6.4.5 关于合作猪DQA基因外显子2的多态性的分析 124 6.4.6 关于SLA Ⅰ类分子和Ⅱ类分子基因组中内含子的多态性 124-125 6.4.7 合作猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子等位基因新的SNPs位点的预测分析 125 6.4.8 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测 125 6.4.9 关于抗原结合区编码外显子序列的多态性 125-127 第七章 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子上游启动子区序列的分析及新等位基因的预测 127-148 7.1 材料 127 7.2 实验方法 127 7.3 结果与分析 127-145 7.3.1 基因组的克隆和测序 127 7.3.2 SLA Ⅰ类分子上游启动子区序列的分析及新等位基因的预测 127-134 7.3.3 SLA Ⅱ类分子上游启动子区序列的分析及新等位基因的预测 134-142 7.3.4 DRB和DQB URR序列的遗传进化关系 142-145 7.4 讨论 145-148 7.4.1 关于SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子基因启动子区的多态性探讨 145 7.4.2 关于SLA Ⅰ类分子和Ⅱ类分子基因启动子区各调控元件的功能的探讨 145-146 7.4.3 关于SLA Ⅱ类分子基因DQB和DRB启动子区等位基因的分类 146 7.4.4 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子启动子等位基因新的SNPs位点的预测 146 7.4.5 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子启动子新等位基因的预测 146-147 7.4.6 SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子等位基因上游调控区多态性与基因的表达调控 147-148 第八章 结论 148-149 参考文献 149-155 附录1 溶液的配方 155-156 附录2 克隆载体PMD~(TM)18-T质粒图谱 156-157 附录3 克隆载体PGEM-TEASY质粒图谱 157-158 附录4 载体PCDNA3.1/CT-GFP-TOPO质粒图谱 158-159 附录5 合作猪与商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子CDNA序列 159-162 致谢 162-163 导师简介 163-164 作者简介 164-166
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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