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苦荞过敏原共表达及TBb抗原表位的研究

作　者: 贺东亮
导　师: 张政；王转花
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苦荞 过敏原 抗原表位 共表达 复性 免疫学活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 34次
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内容摘要


苦荞麦作为“药食同源”的粮食作物,其营养成分种类丰富,含量均衡。然而,近年来的研究发现,荞麦中含有的过敏性成分通常可使接触或食用它的人产生过敏症状。而与过敏反应相关的仅为其抗原决定簇,即能刺激抗体产生的部位（数个至数十个氨基酸）,被称为表位。本实验室在以往研究的基础上获得了一种编码苦荞过敏蛋白全长的cDNA序列,命名为TBt,并于2006年在GenBank上登录（登录号为DQ849083）。此苦荞过敏蛋白TBt由两个结构域组成,即N端结构域（TBb）和C端结构域（TBa）,对N端结构域TBb的研究表明,该过敏蛋白能与荞麦过敏病人血清中的IgE抗体特异性结合,具有较高的免疫学活性。本研究根据已获得的苦荞过敏蛋白N端结构域TBb的氨基酸序列,运用DNAStar软件,综合分析了TBb的二级结构、亲水性、可及性、可塑性、抗原性指数,并预测其B细胞表位的分布。结果表明,在TBb蛋白的320个氨基酸残基中共有11个表位,分别位于6-17,31-45,50-57,88-94,103-134,138-146,156-163,178-185,192-220,240-260,267-299区段。为了进一步确定预测表位区的免疫学活性,我们将11个预测表位区分为四组,分别命名为G1、G2、G3、G4。并根据TBb的cDNA序列,设计引物,克隆了该四个表位区段基因,同时构建了四个原核表达载体（pQE31-G1、pQE31-G2、pQE31-G3、pQE31-G4）,转入大肠杆菌M15中进行表达。对表达产物进行Ni2+-NTA亲和层析纯化,分别获得了纯度较高的重组表位区蛋白。通过ELISA对得到的目的蛋白进行了免疫学活性鉴定和比较,初步确定表位区段G2为苦荞过敏原TBb的主要抗原表位。这为进一步研究苦荞过敏原TBb的突变体和特异性抗体的制备奠定了基础。为了揭示全长苦荞过敏蛋白两个亚基TBa和TBb之间的相互关系,本研究将实验室先前构建的两个表达载体pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,同时转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,表达蛋白以包涵体的形式存在。在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠,ELISA检测表明,复性后的蛋白的免疫学活性得到了提高。由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法。

全文目录


中文摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第一章 文献综述  11-19
  1 食物过敏及其发病机理  11
  2 食物过敏原的种类和检测方法  11-12
  3 过敏原表位的类型和研究进展  12-14
    3.1 抗原表位的分类  12-13
    3.2 抗原表位的预测  13-14
  4 共转化、共表达以及包涵体复性的研究进展  14-16
    4.1 外源基因在大肠杆菌中的共表达策略  14-15
    4.2 包涵体复性的研究方法  15-16
  5 本研究的目的和意义  16-17
  参考文献  17-19
第二章 苦荞过敏蛋白TBb抗原表位的预测及其表达  19-31
  1 材料  19-20
    1.1 菌株和质粒  19
    1.2 主要的工具酶及试剂  19-20
    1.3 主要实验仪器  20
  2 方法  20-26
    2.1 表位预测  20-22
    2.2 TBb蛋白预测表位的克隆策略  22-23
    2.3 重组质粒pQE31-G1的构建  23-25
    2.4 E.coli M15/pQE31-G1的诱导表达  25
    2.5 预测表位区G2、G3、G4的克隆表达  25-26
  3 结果  26-29
    3.1 TBb的表位预测结果  26
    3.2 目的基因片段的PCR扩增结果  26-27
    3.3 重组表达载体的构建及双酶切鉴定  27-28
    3.4 预测表位区段蛋白的诱导表达  28-29
  4 讨论  29-30
  参考文献  30-31
第三章 苦荞过敏原TBa和TBb的共表达及其包涵体的复性  31-35
  1 材料  31
    1.1 菌株和质粒  31
    1.2 主要试剂及实验仪器  31
  2 方法  31-32
    2.1 重组质粒共转化及阳性克隆的筛选  31-32
    2.2 重组质粒在E.coli BL21(DE3)中共表达  32
    2.3 SDS-PAGE分析  32
    2.4 包涵体蛋白的复性  32
  3 结果  32-33
    3.1 重组蛋白在E.coli BL21(DE3)共表达的电泳检测  32-33
    3.2 共表达蛋白包涵体复性检测  33
  4 讨论  33-34
  参考文献  34-35
第四章 TBb预测表位区段以及共表达蛋白的免疫学活性分析  35-42
  1 材料  35-36
    1.1 Ni~(2+)-NTA亲和纯化及免疫学活性检测试剂  35-36
    1.2 主要实验仪器  36
  2 方法  36-37
    2.1 表位区域蛋白的纯化  36-37
    2.2 蛋白浓度及免疫学活性检测  37
  3 结果  37-40
    3.1 表位蛋白的Ni~(2+)柱亲和纯化  37-39
    3.2 免疫学活性分析  39-40
  4 讨论  40-41
  参考文献  41-42
小结与展望  42-43
  1 小结  42
  2 展望  42-43
个人简历  43
硕士期间己发表的论文  43-44
致谢  44-45

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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