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共表达SHMT和TPase载体的构建以及双酶法合成L-色氨酸的研究

作　者: 李鑫
导　师: 刘军
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 丝氨酸羟甲基转移酶色氨酸酶共表达乳糖诱导双酶法合成L-色氨酸
分类号: TQ922
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究构建了单表达丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)基因工程菌、单表达色氨酸酶(TPase)基因工程菌和共表达SHMT和TPase基因工程菌。利用乳糖诱导三种重组工程菌表达产酶,并优化诱导产酶的条件。利用重组基因工程菌进行两菌两次发酵产酶和单菌一次发酵产酶,采用双菌双酶法和单菌双酶法两种途径完成酶法合成L-色氨酸,并比较两种酶法合成L-色氨酸途径的特性。1以大肠杆菌K-12基因组为模板,PCR扩增了编码SHMT和编码TPase的基因。将PCR产物纯化并回收,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切,回收酶切片段,并分别与同样经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切的质粒pET-28a载体相连接,构建重组质粒pET-SHMT和pET-TPase。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建单表达SHMT基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT和单表达TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-TPase。将已构建的质粒pET-TPase经BglⅡ和HindⅢ双酶切,并回收含有T7启动子和TPase基因的DNA片段。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切处理已构建的质粒pET-SHMT,并将纯化后的酶切产物与含T7启动子和TPase基因的DNA片段相连,构建共表达重组质粒pET-ST。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建共表达SHMT和TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST。2以摇瓶发酵为基础,探讨了单表达SHMT、单表达TPase、共表达SHMT和TPase三种基因工程菌在乳糖诱导下的表达,研究了乳糖诱导浓度、诱导起始生长量、诱导培养温度、诱导培养时间对所产酶活性的影响。对于单表达SHMT基因工程菌BL21(DE3)/pET-SHMT,其优化条件为:最适乳糖浓度8g/L;最佳起始生长量为OD600值达到1.0左右;最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6h。以最佳诱导条件培养工程菌,其产SHMT酶活达到220.7(U/mL),相比野生菌提高了6.4倍。对于单表达TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-TPase,其优化条件为:最适乳糖浓度12g/L;最佳起始生长量为OD600值达到1.0左右;最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6h。以最佳诱导条件培养工程菌,其产TPase酶活达到113.7(U/mL),相比野生菌提高了8.4倍。对于共表达SHMT和TPase基因工程菌BL21(DE3)/pET-ST,其优化条件为:最适乳糖浓度12g/L;最佳起始生长量为OD600值达到1.0左右;最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为6h。以最佳诱导条件培养工程菌,其产SHMT酶活达到210.2(U/mL),相比野生菌提高了6.1倍;其产TPase酶活达到93.5(U/mL),相比野生菌提高了6.9倍。3双菌双酶法首先以单表达SHMT基因工程菌所产SHMT作为酶源,利用甘氨酸和甲醛为原料合成L-丝氨酸,甘氨酸的加入量为30g,甲醛以流加的方式加入,并利用其控制反应液的pH值在6.8~7.2之间。反应结束后收集L-丝氨酸反应液,并向其中加入9g吲哚,在单表达TPase基因工程菌所产TPase催化下,反应合成L-色氨酸。此途径甘氨酸的转化率为83.3%,吲哚转化率为92.5%,高效液相测定L-色氨酸的累积量为41.5g/L。4单菌双酶法以共表达基因工程菌所产SHMT和TPase作为酶源,L-丝氨酸和L-色氨酸两步合成反应在同一反应罐中同时进行。设计三组不同的原料加入量,其中原料加入量为25g甘氨酸和7g吲哚时,原料转化率和产物累积量均较高,甘氨酸和吲哚的转化率分别为82.7%和82.9%,高效液相测定L-色氨酸的累积量为28.9 g/L。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第1章文献综述  12-22
  1.1 L-色氨酸的理化性质  12
  1.2 L-色氨酸的用途  12-14
    1.2.1 在食品工业中的应用  12-13
    1.2.2 在饲料工业中的应用  13
    1.2.3 在医药工业中的应用  13-14
  1.3 L-色氨酸的生产方法  14-18
    1.3.1 蛋白水解法和化学合成法  14
    1.3.2 生物转化法  14-15
    1.3.3 直接发酵法  15-16
    1.3.4 酶法  16-18
  1.4 基因工程在氨基酸生产上的应用  18-19
    1.4.1 丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)基因工程菌的构建  18-19
    1.4.2 色氨酸酶(TPase)基因工程菌的构建  19
  1.5 pET 系统和乳糖诱导  19-21
  1.6 本研究的目的和意义  21-22
第2章单表达 SHMT、单表达 TPase 和共表达 SHMT 和 TPase 基因工程菌的构建  22-35
  2.1 材料与方法  22-29
    2.1.1 实验材料  22-23
    2.1.2 实验方法  23-27
    2.1.3 单表达基因工程菌的构建  27-29
    2.1.4 共表达基因工程菌的构建  29
  2.2 结果与讨论  29-33
    2.2.1 单表达SHMT 和单表达TPase 基因工程菌的构建  29-31
    2.2.2 共表达SHMT 和TPase 基因工程菌的构建  31-33
  2.3 小结  33-35
第3章乳糖诱导基因工程菌的表达  35-51
  3.1 材料和方法  35-40
    3.1.1 实验材料  35-36
    3.1.2 实验方法  36-40
  3.2 结果与讨论  40-49
    3.2.1 单表达SHMT 基因工程菌诱导表达条件的优化  40-43
    3.2.2 单表达TPase 基因工程菌诱导表达条件的优化  43-48
    3.2.3 共表达SHMT 和TPase 基因工程菌诱导表达条件的优化  48
    3.2.4 宿主菌和基因工程菌表达量和产酶活性比较  48-49
  3.3 小结  49-51
第4章双酶法合成 L-色氨酸  51-57
  4.1 材料与方法  51-54
    4.1.1 实验材料  51
    4.1.2 实验方法  51-54
  4.2 结果与讨论  54-55
    4.2.1 基因工程菌的小试发酵  54
    4.2.2 双菌双酶法合成L-色氨酸  54-55
    4.2.3 单菌双酶法合成L-色氨酸  55
  4.3 小结  55-57
第5章结论与展望  57-60
  5.1 本研究的主要结论  57-58
  5.2 本研究的创新之处  58
  5.3 展望  58-60
参考文献  60-65
致谢  65-66
缩写符号说明  66-67
攻读学位期间的研究成果  67

共表达SHMT和TPase载体的构建以及双酶法合成L-色氨酸的研究

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